董吉冉 陳嘉川 吉興香

摘 要：為了脫除桉木預水解液中的小分子木素，采用漆酶協(xié)同活性炭處理方法，對經(jīng)過Ca（OH）2和活性炭分別處理過的二級桉木預水解液進行脫木素處理，探討漆酶處理過程中pH值、處理溫度、漆酶用量和處理時間對木素脫除效率的影響。采用單因素實驗結合響應面法對上述主要因素進行了模型分析與驗證，建立了小分子木素脫除的數(shù)學模型。結果表明，經(jīng)過漆酶處理后的二級處理液，其木素脫除率比未用漆酶處理的提高了12.8個百分點。二級處理液中木素脫除率的4個因素影響大小的順序為：pH值>漆酶用量>處理溫度>處理時間。漆酶協(xié)同活性炭處理的較優(yōu)工藝條件為：pH值為5.23、處理溫度45.3℃、漆酶用量5.68 U/g（相對于處理液質量）、處理時間190 min，此條件下二級處理液中木素脫除率的預測值為65.1%，實際測定平均值為65.1%，木素脫除率為桉木預水解液所含木素的90.5%。

關鍵詞：桉木；預水解液；漆酶；活性炭；小分子木素

中圖分類號：TS71；TS245.8

文獻標識碼：A

DOI：10.11980/j.issn.0254-508X.2018.09.002

Abstract：In this work， laccase combined with activated carbon were used to remove small molecular lignin from secondary Eucalyptus pre-hydrolysis liquid which was treated with Ca（OH）2 and activated carbon successively. The effects of pH value， treatment temperature， laccase dosage and treatment time on lignin removal efficiency were analyzed. The main factors were analyzed and verified by single factor experiment and response surface method， and a mathematical model for the removal of small molecule lignin was established. The results showed that compared with secondary purified liquid without laccase treatment， the lignin removal rate increased by 12.8 percentage points after laccase treatment. And the 4 main factors affecting lignin removal rate from strong to weak were： pH treatment value of laccase >laccase dosage> treatment temperature>treatment time. Under the optimum treatment condition （pH=5.23， temperature 45.3℃， laccase dosage 5.68 U/g purified liquid and treatment time 190 min）， the predicted maximum lignin removal rate in the liquid solution was 65.1%， and the actual measured value 65.1%. The lignin removal rate was 90.5% based on the Eucalyptus pre-hydrolysate.

Key words：Eucalyptus； pre-hydrolysis liquid； laccase； active carbon； small molecular lignin

近年來，溶解漿的市場需求量呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，在生產(chǎn)硫酸鹽闊葉木溶解漿的過程中，一般先進行預水解溶出部分半纖維素，以降低后續(xù)工段木質纖維組分分離過程中的化學品消耗量，提高溶解漿的品質，同時也會產(chǎn)生大量預水解液，預水解液中水分含量較高（>90%），各種半纖維素含量也較高，但各種半纖維素的熱值（13.6 MJ/kg）僅為木素（27 MJ/kg）的1/2。部分企業(yè)在生產(chǎn)中通常將預水解液與黑液一起燃燒產(chǎn)生熱量，因而造成了半纖維素資源的浪費[1-3]。目前，生物質精煉受到人們越來越多的重視，如何高效環(huán)保地利用預水解液中的溶解有機物，成為當今科研工作者的研究熱點。闊葉木預水解液中包含大量的半纖維素、糠醛、乙酸等溶解有機物，可用來生產(chǎn)多種高附加值產(chǎn)品，如木糖醇、燃料乙醇、生物柴油、乙酸、糠醛、樹脂等[4-6]；特別是預水解液中的大量低聚木糖可用來生產(chǎn)多種保健功能性低聚糖產(chǎn)品，在食品醫(yī)藥行業(yè)受到廣泛關注[7]。當前從水解液中提取低聚木糖的方法較多，如膜處理、乙醇沉淀、有機溶劑萃取等。Wang Q等人[8]以水熱預處理液為原料，通過納濾和漆酶處理得到濃縮的半纖維素糖液；Blanc C L等人[9]對預水解液進行純化，從半纖維素糖液中提取戊糖； Yang G等人[10-11]以預水解液為原料，利用三辛胺/正辛醇系統(tǒng)將乙酸萃取出來，之后又利用氫氧化鈉進行反萃取進而生產(chǎn)乙酸；Ahsan L等人[12]和Baktash M M等人[13]以工業(yè)預水解液為原料，生產(chǎn)糠醛。由此可見，要想利用預水解液中溶解的有機物生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，首先要將水解液進行純化。而預水解液中的有機物成分復雜，主要是低聚木糖、木糖和木素，其中，木素的存在不利于木糖的提取與高值化利用，易導致木糖產(chǎn)品純度和質量降低。因此，如何有效地去除預水解液中的木素是生產(chǎn)木糖基高附加值產(chǎn)品的重要基礎。

近年來，去除預水解液中木素的方法主要有物理法、化學法和生物法。物理法主要指活性炭處理，利用其豐富的微孔以及巨大的比表面積來吸附木素，該方法成本低、污染小，但對于預水解液中尺寸較小或較大的木素，活性炭吸附能力較弱。Shen J等人[14]利用活性炭結合離子交換樹脂和膜過濾來脫除預水解液中的木素，木素的脫除率達到90%，但處理成本相對較高。Chandel A K等人[15]用活性炭處理預水解液，可脫除38.7%的呋喃，57%的酚類物質?；瘜W法主要包括聚電解質法和酸析沉淀法。聚電解質法是通過加陽離子聚電解質發(fā)生電荷中和反應，形成絮聚體，然后離心過濾以脫除預水解液中的木素。酸析沉淀法則主要用于堿處理預水解液的純化。Duarte G V等人[16]采用陽離子絮凝劑聚二烯丙基二甲基氯化銨可脫除36%的木素。Liu Z H等人[17]在室溫下向預水解液中加入質量分數(shù)20%的硫酸，調節(jié)預水解液pH值為2，此時木素去除率為50%，但糖類損失16%?？梢姡瘜W法脫除木素效果不理想，而且會對環(huán)境產(chǎn)生污染。生物法主要是利用漆酶氧化苯酚末端基形成較穩(wěn)定的自由基，自由基之間再耦合形成共價鍵，小分子木素縮合形成大分子[18-19]。該法操作簡單、效果明顯，是一種環(huán)境友好型的處理方法，近年來在純化預水解液方面得到了較廣泛的研究和應用。Kolb M等人[20]利用0.2～0.5 U/mL的漆酶處理水解液24 h，幾乎所有的木素降解產(chǎn)物被脫除；Wang Q等人[21]通過漆酶處理預水解液，發(fā)現(xiàn)漆酶處理后，木素的相對分子質量提高了160%，之后通過絮聚除去，木素脫除率由11%提高到46%～61%。

本課題針對預水解液中小分子木素難脫除的問題，通過漆酶處理誘導其縮合[22]，調節(jié)小分子木素的尺寸，使其尺寸達到活性炭易于吸附的范圍，并利用響應面法建立漆酶用量、pH值、處理溫度、處理時間與木素脫除率之間的數(shù)學模型，以減少傳統(tǒng)多因素正交實驗的誤差，縮短優(yōu)化時間，提高結果的準確度。

1 實 驗

1.1 實驗原料及試劑

桉木預水解液由山東太陽紙業(yè)有限公司提供；漆酶購于諾維信公司（酶活5000 U/mL）；活性炭（磷酸活化、木質、過200目）購于廣東海燕活性炭有限公司；Ca（OH）2和H2SO4均為分析純，購于天津恒興公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桉木預水解液二級處理液的制備

向桉木預水解液中加入1.5%（以預水解液質量計）的Ca（OH）2，處理10 min后離心，取上清液，稱為一級處理液；向一級處理液中加入1.0%的活性炭，吸附5 min后離心過濾，取上層清液，稱為二級處理液。各級處理液中木素含量及總木糖的含量如表1所示。其中，活性炭處理木素脫除率為53.5%，總木糖損失率為5.9%。

1.2.2 漆酶處理二級處理液

對照組：取180 g二級處理液平均分成6組置于錐形瓶中，未加入漆酶，將錐形瓶放入搖床中，在150 r/min下處理3 h。處理結束后，分別向各組中加入1.0%活性炭（AC-raw）（以二級處理液質量計以下同），置于磁力攪拌器上，250 r/min下攪拌5 min，然后在4500 r/min下離心3 min，取上清液，用于木素含量的測定。離心所得活性炭記為AC-1。

實驗組：另取180 g二級處理液平均分成6組置于錐形瓶中，各組分別加入30 μL漆酶溶液，將錐形瓶放入搖床中，重復上述實驗過程。離心所得活性炭記為AC-2。

1.2.3 漆酶協(xié)同活性炭處理后木素及總木糖含量的測定

取180 g上述經(jīng)過漆酶處理過后的二級處理液，平均分為6組，置于錐形瓶中，向錐形瓶中分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的活性炭，置于磁力攪拌器上，在250 r/min下攪拌5 min，然后在4500 r/min下離心3 min，取上清液，用于木素及總木糖含量的測定。

木素含量的測定：木素含量的測定按照GB/T 2677.8—1994進行。將上清液稀釋適宜倍數(shù)，采用紫外分光光度計檢測上清液樣品在205 nm處的吸光值，木素含量計算如公式（1）所示。

B=A·D/110（1）

式中，B為上清液中的木素含量，g/L；A為稀釋后的上清液樣品在205 nm處吸光值；D為上清液樣品的稀釋倍數(shù)；110為吸光系數(shù)，L/（g·cm-1）。

總木糖含量測定：取5 mL上清液放入耐壓瓶中，加入174 μL、質量分數(shù)為72%的H2SO4，將耐壓瓶密封后放入油浴中，121℃下反應60 min進行酸水解[23]。將經(jīng)酸水解之后的上清液，再稀釋4000倍，采用ICS-5000型離子色譜測定儀測定木糖含量，即為上清液中總木糖含量。

1.3 檢測

1.3.1 FT-IR表征

取1 mg吸附二級處理液前后的活性炭樣品，與100 mg干燥的KBr經(jīng)瑪瑙研缽研磨后壓片，置于Vertex70傅里葉變換紅外光譜分析儀（FT-IR）（德國布魯克Vertex70）中測試，掃描范圍為250～4250 cm-1，掃描次數(shù)為16次。

1.3.2 比表面積測試

取0.1 g 吸附二級處理液前后的活性炭樣品置于樣品管中，在比表面積測定儀（北京金埃譜v-sorb2008p）中進行測試，測試方法為等溫（77 K）N2吸附法。

1.3.3 TEM分析

將吸附二級處理液前后的活性炭，分別用水稀釋一定濃度后，超聲處理10 min，使其均勻分散，后滴加少量含活性炭的懸濁液于銅網(wǎng)上，60℃下烘干。然后置于JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡（TEM）（日本電子公司JEM-2100）下觀察，所用電壓為200 kV。

2 結果與討論

2.1 活性炭用量對漆酶處理后二級處理液中木素脫除率及總木糖損失率的影響

活性炭用量對漆酶處理后二級處理液中木素脫除率及總木糖損失率的影響見圖1。

由圖1中可以看出，隨著活性炭用量的不斷增加，木素脫除率呈現(xiàn)先快速增加后緩慢增加的趨勢，總木糖損失率呈現(xiàn)先緩慢增加后快速增加的趨勢。這主要是因為活性炭吸附具有選擇性，即活性炭會優(yōu)先選擇吸附木素。在活性炭用量小于1%時，由于漆酶處理后二級處理液中小分子木素被漆酶縮合為較大相對分子質量的木素，使得木素易于被活性炭吸附[24]，但同時由于木素占據(jù)了活性炭較多活性位點，使得活性炭對糖的吸附作用不明顯，總木糖損失率較低；隨著活性炭用量的不斷增加，在活性炭用量為1.2%時，由于漆酶處理后二級處理液中木素含量有限，但活性炭中吸附位點較多，除了吸附木素分子之外，對糖的吸附也明顯增加，總木糖損失率高達7.0%。另外，由于活性炭對木素的吸附能力高于木糖[24]，由表1可知，在活性炭處理二級處理液過程中，活性炭吸附了53.5%的木素，而對木糖的吸附僅為5.9%。這表明在漆酶協(xié)同活性炭處理二級處理液的過程中，會優(yōu)先吸附木素，但隨著木素濃度的不斷降低，活性炭剩余的活性位點開始吸附木糖。當活性炭用量為1.0%時，此時的木素脫除率較高為64.5%，總木糖損失率較低為3.3%。因此，后續(xù)實驗均采用1.0%的活性炭用量。

2.2 漆酶處理對二級處理液中木素脫除效果的影響

以未經(jīng)漆酶處理的二級處理液作為對照組，經(jīng)過漆酶處理的二級處理液作為實驗組，漆酶處理對二級處理液中木素的脫除效果的影響見表2。

由表2可以看出，在相同處理條件下，與對照組相比，實驗組的木素脫除率提高了12.8個百分點。漆酶處理后二級處理液中的木素濃度為0.94 g/L，相對于桉木預水解液中的木素（9.72 g/L），木素脫除率為90.3%。由此說明，經(jīng)過漆酶處理后，二級處理液中的小分子木素更容易脫除。

2.3 單因素優(yōu)化漆酶處理工藝條件

漆酶處理過程中酶用量、pH值、處理溫度、處理時間對二級處理液中木素脫除率的影響見圖2。

由圖2（a）中可以看出，隨著漆酶用量的不斷增加，木素脫除率呈現(xiàn)先增加后平緩下降的趨勢，這可能與漆酶自身性質有關[25]，漆酶對木素既有縮合作用也有解聚作用[26]，在漆酶用量較少時，基于二級處理液中的木素含量較低，且相對分子質量較小，漆酶對木素主要體現(xiàn)為縮合作用，使木素尺寸與活性炭的孔徑更為相近，木素更易于被活性炭吸附，因而木素脫除率增加。當漆酶用量增加到5 U/g時，漆酶的縮合作用與解聚作用相當，反應達到平衡，此時木素脫除率最大，為64.5%；隨著漆酶用量的繼續(xù)增加，漆酶解聚作用占據(jù)優(yōu)勢，縮合的木素小分子被漆酶解聚，使得木素脫除率降低[18]。因此，當漆酶用量為5 U/g時，對二級處理液中木素的脫除效果較好。由圖2（b）看出，隨著pH值的不斷增加，木素脫除率呈現(xiàn)先明顯增加后逐漸下降的趨勢。在pH值為5時，木素脫除率達最高值，為64.5%，這說明漆酶在pH值為5時具有較高的催化活性，對木素的降解效果較好。當pH值為6～8時，木素脫除率有所下降，但并不明顯，這說明漆酶在弱堿環(huán)境下，仍具有良好的催化活性。由圖2（c）可以看出，隨著處理溫度的不斷增加，木素脫除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當處理溫度為45℃時，木素脫除率最高。這說明該漆酶在45℃時具有較高的催化活性，對木素的脫除效果較好。由圖2（d）可以看出，隨著處理時間不斷延長，木素脫除率先增加后趨于穩(wěn)定，在處理時間為3 h時，木素脫除率最高。

2.4 響應面分析法優(yōu)化漆酶處理工藝條件

2.4.1 響應面實驗設計方案與響應值結果

在單因素實驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計了漆酶處理二級處理液中木素的實驗，并對實驗數(shù)據(jù)進行了回歸驗證和響應面分析法。在此驗證過程中，各因素和水平見表3，響應面實驗設計方案與響應值結果見表4。

2.4.2 模型建立與方差分析

模型方差分析和回歸系數(shù)顯著性驗證結果如表5所示，再利用Design-Expert 8.0.6軟件對表5數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到了響應值木素脫除率R對影響木素脫除率的的主要因素的二元多項式回歸模型如公式（2）所示。

R=64.46+2.05A+2.49B+1.31C+1.69D+1.07AB-0.62AC-0.44AD-0.78BC-0.34BD-4.3CD-4.9A2-5.84B2-6.08C2-4.4D2（2）

由表5可以得出， 當P值<0.0001，失擬項不存在，表明該回歸模型達到極為顯著的水平。同時，該方程的回歸系數(shù)R2=0.9411，說明該模型擬合度較高，可以用來分析及預測二級處理液中木素的脫除情況。另外，根據(jù)F值的大小表明4個因素對二級處理液中木素脫除率影響的大小順序為： pH值>漆酶用量>處理溫度>處理時間。

2.4.3 各因素交互作用結果

pH值、漆酶用量、處理溫度和處理時間各因素之間交互作用對木素的脫除率結果如圖3所示。

由圖3（a）可知，在pH值小于5時，木素脫除率隨漆酶用量的增加呈現(xiàn)先緩慢上升后逐漸下降的趨勢。在pH值為5～6時，木素脫除率隨漆酶用量的增加迅速上升至最高點，然后又快速下降。這主要是因為漆酶對溶液的pH值較為敏感， pH值的改變會影響酶活性基團的解離程度，同時還會影響底物和輔酶的解離和結合，因此在特定的pH值范圍內，漆酶、底物和輔酶的離解狀態(tài)較適宜，使得漆酶反應活性最高。

由圖3（b）和圖3（d）表明，當處理溫度在35～55℃時，木素脫除率隨pH值的增大或漆酶用量的增加，呈現(xiàn)先緩慢增加后逐漸減小的趨勢。從酶促反應動力學角度分析可知，提高溫度可以使酶催化反應速度加快。但是，若溫度過高會導致酶蛋白因變性而失活，會降低酶催化反應速度。由圖3（c）和圖3（e）可知，在pH值或漆酶用量一定時，木素脫除率隨時間的延長，先緩慢增加后緩慢下降。由圖3（f）可知，木素脫除率隨處理時間的延長先緩慢增大后逐漸減小；當處理溫度較高時，木素脫除率隨著處理時間的增大迅速增大后又快速減小。綜上可知，當pH值為5、漆酶用量為5 U/g、處理溫度45℃、處理時間3 h時，二級處理液的木素脫除率較高，為64.5%。

2.4.4 模型驗證

基于Design-Expert軟件的優(yōu)化功能分析得出脫除二級處理液中木素的較優(yōu)條件為：pH值為5.23、漆酶用量5.68 U/g、處理溫度45.3℃、處理時間190 min，為了驗證木素脫除模型的可靠性，在此條件下進行了4組模型驗證實驗，結果見表6。

由表6可以看出，4組模型驗證實驗所得木素脫除率的實際測定平均值為65.1%，與預測值的相對誤差均在1.5%以下，這說明通過響應面法優(yōu)化得到的脫除木素的工藝條件可信度較高。另外，結合表4可知，經(jīng)過漆酶協(xié)同活性炭處理后，所得處理液中的木素相對于桉木預水解液的木素脫除率為90.5%。

2.5 FT-IR分析

活性炭吸附二級處理液前后的紅外光譜圖，如圖4所示。

由圖4可以看出，與未吸附二級處理液的活性炭（AC-raw）相比，吸附二級處理液之后的活性炭（AC-1、AC-2），在1425 cm-1處均出現(xiàn)吸收峰，該處為芳香核振動吸收峰；在1145 cm-1處出現(xiàn)不太明顯的吸收峰，該處由愈創(chuàng)木基振動引起；在1030 cm-1處有較強的吸收峰，該處由愈創(chuàng)木基的C—H彎曲、伯醇C—O彎曲振動引起，這說明活性炭在處理二級處理液過程中吸附了部分木素，且AC-2在1030 cm-1處的吸收峰大于AC-1，這表明經(jīng)過漆酶處理后，二級處理液中有更多的木素被活性炭吸附。

2.6 比表面積分析

活性炭吸附二級處理液前后的比表面積測定結果見表7。

由表7可以看出，與AC-raw相比，吸附二級處理液后的AC-1和AC-2的比表面積與孔體積均有大幅度減少，微孔面積與微孔體積均為0，說明活性炭吸附了大量的木素，且微孔對于木素的吸附能力更強。與AC-1相比，AC-2中孔比表面積與孔體積均有明顯減小，這說明經(jīng)過漆酶處理后的二級處理液中木素相對分子質量增大，達到了活性炭中微孔易于吸附的范圍，由此說明漆酶可以縮合水解液中的小分子木素，使其更易于被脫除。

2.7 TEM分析

圖5為活性炭處理二級處理液前后的透射電鏡（TEM）圖。

由圖5可以看出，與未經(jīng)過吸附處理的活性炭（圖5（a））相比，經(jīng)過吸附處理二級處理液后的活性炭（圖5（b）和圖5（c）），光透過性相對較差，晶格結構不太明顯，這說明吸附處理二級處理液后的活性炭孔內吸附了大量的木素。另外，與AC-1相比，AC-2的光透過性下降更明顯，這說明經(jīng)過漆酶處理后，二級處理液中的木素更易于被活性炭吸附。因此，漆酶的加入有利于二級處理液中小分子木素的脫除。

3 結 論

采用單因素實驗結合響應面法對影響漆酶協(xié)同活性炭處理脫除桉木預水解液中木素的各影響因素進行了優(yōu)化研究。

3.1 與未用漆酶處理的二級處理液相比，經(jīng)過漆酶處理后的二級處理液，其木素脫除率提高了12.8個百分點。

3.2 通過單因素實驗結合響應面法對桉木預水解液的二級處理液中木素脫除率進行了模型分析與驗證，得出二級處理液中木素脫除率4個因素的影響大小順序為：pH值>漆酶用量>處理溫度>處理時間。

3.3 漆酶協(xié)同活性炭脫除二級處理液中木素的較優(yōu)工藝條件為：pH值為5.23、處理溫度45.3℃、漆酶用量5.68 U/g處理液、處理時間190 min，在此條件下，二級處理液中木素脫除率的最大預測值為65.1%，實際測定平均值為65.1%，相對于桉木預水解液的木素脫除率達到90.5%。

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（責任編輯：吳博士）