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        小麥中嘔吐毒素不同檢測方法的對比研究

        2018-09-10 23:53:22吳藝影應(yīng)玲紅盛林霞陳舒萍
        糧食科技與經(jīng)濟 2018年5期
        關(guān)鍵詞:小麥

        吳藝影 應(yīng)玲紅 盛林霞 陳舒萍

        【摘要】為了研究小麥中嘔吐毒素不同檢測方法的差異性與相關(guān)性,尋找小麥入庫作業(yè)時快速檢測法可靠性范圍,對45份小麥樣品進(jìn)行膠體金試紙條、ELISA、HPLC的檢測。結(jié)果顯示:試紙條法(1000μg/kg)結(jié)果呈陰性為合格樣品,呈陽性需HPLC復(fù)檢;ELISA結(jié)果小于1000μg/kg時為合格樣品,結(jié)果為1000~1300μg/kg時需HPLC復(fù)檢,結(jié)果大于1300μg/kg為不合格樣品。

        【關(guān)鍵詞】膠體金試紙條;ELISA;HPLC;小麥;嘔吐毒素

        嘔吐毒素(vomitoxin),又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON),由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生,屬單端孢霉烯族化合物。近年來隨著氣候變化,嘔吐毒素污染糧食呈上升趨勢,尤其是小麥被污染后產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降,毒素難以去除。人和動物食用被污染的小麥及其制品后會對健康造成威脅,因此高效、準(zhǔn)確地檢測出嘔吐毒素含量具有重要意義。

        作為儲備糧庫,主要使用了膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)等方法檢測嘔吐毒素。膠體金試紙條法簡便快速,可用肉眼進(jìn)行定性分析,檢測成本低。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對樣品純度要求不高,特異性強。以上兩種方法均屬于快速檢測法,不能準(zhǔn)確定量,易受到溫度等條件的影響,存在較大的誤差。高效液相色譜法(HPLC)定量準(zhǔn)確,對操作人員要求高且樣品處理比較復(fù)雜,儀器昂貴、檢測成本高、花費時間長、耗費溶劑較多,不適合大批量樣品的快速檢測。

        根據(jù)GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》要求,小麥中嘔吐毒素限量為≤1000μg/kg,糧食入庫作業(yè)時間緊、數(shù)量大,三種方法各有優(yōu)勢,如何區(qū)分使用是重點。本實驗通過對快速檢測法和HPLC法檢測小麥中嘔吐毒素的結(jié)果進(jìn)行比較,探索不同方法之間的差異性與相關(guān)性尋找快速檢測法可靠性范圍,合理使用快速檢測法和HPLC法,降低實驗成本,提高工作效率。

        1材料與方法

        1.1材料與試劑

        試驗樣品:2017年產(chǎn)浙江小麥20份、2015年產(chǎn)山東小麥25份樣品。對照樣品:嘔吐毒素含量為(1137±20%)μg/kg。

        嘔吐毒素免疫親和柱,嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒,嘔吐毒素快速檢測試紙條(500~2000μg/kg);脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品,純度≥98%;甲醇、乙腈,均為色譜級;聚乙二醇(相對分子質(zhì)量8000);玻璃纖維濾紙,直徑llcm,孔徑1.5μm。

        1.2儀器與設(shè)備

        e2695高效液相色譜儀(配2489紫外檢測器):美國Waters公司;HF4500酶標(biāo)儀:北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;HSE-24B固相萃取裝置:天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;MTN-2800W氮吹濃縮裝置:天津奧特賽恩斯儀器有限公司;JFSD-100粉碎機:上海嘉定糧油儀器有限公司;HY-2調(diào)速多用振蕩器:常州國華電器有限公司。

        1.3實驗方法

        共進(jìn)行了5次實驗:每次實驗檢測9份試驗樣品、1份對照樣品,進(jìn)行1次加標(biāo)回收實驗。

        1.3.1膠體金試紙條法

        采用1000μg/kg的檢測限。稱取5.0g均質(zhì)樣本于具塞三角瓶中,加入20mL蒸餾水,充分震蕩5min,靜置過濾。移取50μL濾液加入樣品稀釋液2000μL,混勻后待檢。取出已恢復(fù)至室溫的微孔試劑和試紙條,用移液器取200μL待檢液于微孔試劑中,混勻,室溫孵育4min。將試紙條浸入微孔溶液中,室溫反應(yīng)5min,讀取結(jié)果。

        1.3.2 ELISA法

        稱取5.0g粉碎后的小麥樣品,加入25ml蒸餾水,200r/min振蕩10min,靜置3min后用定量濾紙過濾,取1ml濾液以蒸餾水1:4稀釋,手動搖勻后取50μL進(jìn)行分析。取出已恢復(fù)至室溫的微孔板和液體試劑,按照說明書的要求操作點樣。

        檢測參數(shù):設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm/630nm處檢測,讀取濃度。

        1.3.3 HPLC法

        采用GB 5009.111-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?;苌锏臏y定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法。

        為避免樣品不均勻性導(dǎo)致的誤差,ELISA法和HPLC法采用同一份濾液。將濾液經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾,移取2.5ml濾液過免疫親和柱,收集洗脫液,在50~60℃條件下氮吹近干,加入1mL流動相復(fù)溶,復(fù)溶液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶,準(zhǔn)備進(jìn)樣。

        色譜柱:C18柱(柱長150mm);流動相:甲醇+水(20+80);流速;0.8mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:50μL;檢測波長:218nm。

        1.3.4加標(biāo)回收實驗

        為驗證前處理損失大小、檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗,標(biāo)準(zhǔn)品添加量為1000μg/kg。

        2實驗結(jié)果

        2.1對照樣品檢測和加標(biāo)回收實驗合國標(biāo)中回收率要求,實驗結(jié)果可靠。HPLC法和ELISA法最大偏差遠(yuǎn)低于國標(biāo)(HPLC法重現(xiàn)性≤23%,ELISA法重現(xiàn)性≤25%),兩種檢測方法均重現(xiàn)性良好。

        2.2 ELISA-HPLC結(jié)果相關(guān)性

        由圖1可知,兩種方法檢測結(jié)果的一致性較高,線性相關(guān)系數(shù)R=0.984 5。ELISA試劑盒法具有較高的準(zhǔn)確性,可以保證檢測結(jié)果的可靠性。

        2.3臨界值樣品檢測結(jié)果

        以HPLC檢測結(jié)果為劃分依據(jù),對含量在臨界點附近的樣品匯總。其中,試紙條法檢測結(jié)果陰性以“一”表示,陽性以“+”表示。

        由表2~表4可知,樣品DON含量<800μg/kg時,試紙條檢測結(jié)果呈陰性時,EHSA結(jié)果<1000μg/kg;樣品DON含量為800~900μg/kg時,試紙條結(jié)果呈陽性,ELISA結(jié)果在1000μg/kg上下浮動,存在誤差。樣品DON含量為900~1100μg/kg時,試紙條結(jié)果均呈陽性,ELISA在1000μg/kg上下浮動。樣品DON含量為1100~1300μg/kg時,試紙條結(jié)果均呈陽性,ELISA結(jié)果均>1000μg/kg。

        3結(jié)論

        試紙條法具有快速檢測、單個樣品檢測成本低等優(yōu)點,樣品數(shù)量少時可優(yōu)先采用此方法,以1000μg/kg為檢出限,若檢測結(jié)果呈陰性,結(jié)果可靠,判定合格。當(dāng)樣品數(shù)量大,可采用ELISA法,若檢測結(jié)果<1000μg/kg,判定合格;若ELISA檢測結(jié)果為1000~1300μg/kg,或試紙條法呈陽性,應(yīng)采用HPLC檢測法進(jìn)一步檢測DON含量。當(dāng)ELISA檢測結(jié)果>1300μg/kg時,可判定樣品DON含量超標(biāo)。

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