華晨 李新新 涂濤 楊虹 羅會穎 陳家明 姚斌 柏映國 彭書傳

（1. 合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230009；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

乳酸氧化酶能夠催化乳酸氧化為丙酮酸，是重要的制備丙酮酸原料［1］。丙酮酸作為一種新型醫(yī)藥、農(nóng)藥和日化中間體，許多氨基酸的生物合成都需要以丙酮酸為起始物質(zhì)，國內(nèi)外市場需求增長極其迅速，價格居高不下。如L-二羥基-苯丙氨酸（L-DOPA）作為一種有效的抗癌藥物，就是以丙酮酸為原料，在酚基裂解酶的作用下轉(zhuǎn)化而來［2］。同時乳酸氧化酶也廣泛應(yīng)用于傳感器的制備，以檢測血清樣品的乳酸含量［3-4］。乳酸氧化酶作為一種黃素蛋白酶，以FMN作為輔基，其電子轉(zhuǎn)移的形式不同于經(jīng)典的電子傳遞鏈，而是直接以氧作底物，F(xiàn)MN和酶蛋白結(jié)合非常牢固，整個反應(yīng)過程不需要游離的外源輔酶參與，沒有輔酶再生的問題［5］。

但是目前研究發(fā)現(xiàn)的乳酸氧化酶大多熱穩(wěn)定性較差，只能在30-50℃下保持穩(wěn)定［6-7］，在化工合成過程中極易失去大部分酶活性，導(dǎo)致生產(chǎn)效率低下、資源浪費等問題，因此提高乳酸氧化酶的熱穩(wěn)定性具有重要意義。這不僅可以拓寬它的工業(yè)應(yīng)用范圍，而且可以研究酶蛋白結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系。國外學(xué)者已利用各種方法來嘗試提高乳酸氧化酶的熱穩(wěn)定性，Lillis等［8］發(fā)現(xiàn)將乳酸氧化酶固定化可以大大提高乳酸氧化酶的穩(wěn)定性，Hamamatsu等［9］通過易錯PCR結(jié)合定向突變的方式，也得到了有效提高熱穩(wěn)定性的突變體。但我國關(guān)于乳酸氧化酶的研究則主要集中于產(chǎn)酶菌株的分離、酶基因克隆以及工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的拓寬［1，10-11］，對于乳酸氧化酶熱穩(wěn)定性改造方面的研究報道較少。

本研究通過同源建模、序列比對、分子對接技術(shù)以及酶熱穩(wěn)定性系統(tǒng)（Enzyme thermal stability system，ETSS）軟件等生物信息學(xué)手段對乳酸氧化酶的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性分析，嘗試在不損傷酶活力的前提下基于蛋白表面電荷分布優(yōu)化對其進(jìn)行熱穩(wěn)定性改良，以期進(jìn)一步提高乳酸氧化酶的熱穩(wěn)定性，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域，同時也為以后相關(guān)乳酸氧化酶熱穩(wěn)定性的分子改造提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 實驗所用重組載體pET30a-EgLOD為本實驗室克隆、構(gòu)建并保存，其中EgLOD基因來源于鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum strain），GenBank號為 MG547691。大腸桿菌感受態(tài)Escherichia coli DMT、BL21購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑 FastPfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒購自北京TianGen公司；蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司；蛋白Marker購買于北京GeneStar生物公司；IPTG購自北京Solarbio科技有限公司；其他化學(xué)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。引物由北京梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 儀器 PCR，凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），高速冷凍離心機(jī)（日本HIMAC），酶標(biāo)儀（美國Thermo），紫外分光光度計（日本JASO），移液槍（德國Eppendorf），His-tag蛋白磁珠（Beaver），其他實驗儀器均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 EgLOD同源模建 采用在線BLASTp（https://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi） 在pdb數(shù) 據(jù) 庫（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中搜索同源模板，并進(jìn)行E值和序列一致性等參數(shù)的比較分析。利用Discovery Studio（DS）軟件進(jìn)行單模板同源模建，采用DS內(nèi)置的拉氏構(gòu)象圖（Ramachandra plot）評價結(jié)構(gòu)合理性，內(nèi)置的Minimization工具和Verify 3D 優(yōu)化程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并進(jìn)行三維立體結(jié)構(gòu)的可視化分析。

1.2.2 分子對接及結(jié)構(gòu)分析 采用DS軟件對配體和受體進(jìn)行半柔性CDOCKER模擬對接。配體分子為優(yōu)化后的EgLOD pdb蛋白結(jié)構(gòu)，受體分子為FMN和乳酸的pdb結(jié)構(gòu)（PDB庫中下載），根據(jù)文獻(xiàn)報道的活性位點選定對接區(qū)域［12-13］，將 RMSD 閾值設(shè)為 0.5?以確保對接構(gòu)象盡可能具有多樣性。根據(jù)能量打分和構(gòu)象評估選擇最優(yōu)對接結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析。再利用DS對對接后的受體配體復(fù)合物進(jìn)行相互作用力的分析。

1.2.3 多序列比對 在對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步篩選可能影響乳酸氧化酶熱穩(wěn)定性的結(jié)合位點，通過查閱文獻(xiàn)，篩選不同來源但結(jié)構(gòu)相似的其他乳酸氧化酶序列，利用ClustalX 2.0進(jìn)行多序列比對，ESPript 3.0（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進(jìn)行序列催化位點、溶劑可及性、保守性和序列二級結(jié)構(gòu)的分析。

1.2.4 蛋白表面電荷分析 本文將蛋白結(jié)構(gòu)看成一個球體，每一個帶電荷氨基酸則被看成一個點電荷分布在球體上。利用酶熱穩(wěn)定性系統(tǒng)軟件［14-15］計算蛋白結(jié)構(gòu)中每個點電荷的總靜電勢能Eij。負(fù)值的Eij表示所給定的氨基酸殘基對整個蛋白的穩(wěn)定性起到積極的相互作用。相反，正值的Eij表示所給定的氨基酸殘基對整個蛋白的穩(wěn)定性起到不利的相互作用。因此，從理論上講，改變這些Eij為正值的氨基酸殘基就有可能提高蛋白的熱穩(wěn)定性。但ETSS軟件所計算得到的符合條件的氨基酸數(shù)量依然十分龐大，在實際操作中仍需要經(jīng)過其他手段輔助篩選，得到效果最優(yōu)突變體。根據(jù)以下4個原則，對蛋白進(jìn)行再設(shè)計：優(yōu)先選擇Eij為較高正值的殘基進(jìn)行突變試驗；為了保證突變不會使酶活力損失，盡可能選擇一些遠(yuǎn)離活性中心的氨基酸殘基；保留EgLOD乳酸氧化酶中相對保守的氨基酸；通過多序列比對來選擇突變點，當(dāng)正值Eij殘基所在的位置出現(xiàn)帶相反電荷的氨基酸殘基時，則將該正值Eij殘基突變成不帶電荷或者帶相反電荷的殘基；否則，將該正值Eij殘基突變成Ala。

1.2.5 EgLOD突變體的構(gòu)建 以實驗室構(gòu)建并保存的重組質(zhì)粒pET30a-EgLOD為模板，利用FastPfu DNA聚合酶通過上游引物和下游引物對質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，直接用PCR的方法一步構(gòu)建定向單點突變。提取經(jīng)DMT感受態(tài)克隆后的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3），最終得到構(gòu)建好的突變體表達(dá)菌株命名為：BL21-pET30a-EgLOD-Mutant。設(shè)計突變引物見表1。

表1 PCR引物序列

PCR產(chǎn)物直接用DMT酶在37℃處理2 h后轉(zhuǎn)化DMT感受態(tài)細(xì)胞，在固體LB培養(yǎng)基平板（含50 μg/mL Kana）上篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。挑單克隆至600 μL 液體 LB 培養(yǎng)基（含 50 μg/mL Kana）上過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與pET30a-EgLOD比對以確定是否突變成功。

1.2.6 EgLOD及其突變體表達(dá)及純化 誘導(dǎo)表達(dá)：將構(gòu)建好的表達(dá)菌株接種至30 mL LB培養(yǎng)液中過夜活化，后按1%的接種量轉(zhuǎn)接至300 mL的大瓶LB（含50 μg/mL Kana）中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD 600值約為0.6-0.8（約2-3 h）時加入終濃度為0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并轉(zhuǎn)至20℃，190 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)約10-12 h。12 000 r/min，10 min離心收集菌體。

蛋白純化：將離心收集的菌體稱濕重，以每克濕重加入3 mL磷酸鈉緩沖液的比例加入緩沖液，將菌體吹打重懸。冰浴超聲破碎菌體，200 W功率，4 s破碎，3 s暫停，共運行30 min。離心收集上清，上清即為EgLOD及各突變體表達(dá)的粗酶液。粗酶液采用His-tag蛋白磁珠純化，將預(yù)處理的磁珠與粗酶液樣品混合，4℃慢速旋轉(zhuǎn)混合孵育1 h，使兩者充分結(jié)合，依次加入5 mL不同咪唑濃度的清洗液各3次進(jìn)行雜蛋白的洗脫，最后加入洗脫液收集洗脫峰，經(jīng)酶活測定和SDS-PAGE驗證，收集得到純蛋白洗脫峰。

1.2.7 EgLOD及其突變體的比活測定 乳酸氧化酶比活力單位定義：每毫克乳酸氧化酶蛋白中所含有的乳酸氧化酶活力單位（U/mg）。

在酶標(biāo)條中加入5 μL不同濃度的蛋白BSA標(biāo)品（0.125、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/mL）和待測樣品乳酸氧化酶（WT/D250N/ D281N），然后加入250 μL考馬斯亮藍(lán)顯色劑，混勻。室溫反應(yīng)10 min后，測定OD595波長處吸光值。根據(jù)所測得的標(biāo)品吸光值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品（野生型與各突變體）的吸光值代入公式計算出樣品的蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.2.8 EgLOD及其突變體的熱穩(wěn)定性測定 乳酸氧化酶酶活力測定采用DNP法［16］，通過檢測體系中丙酮酸產(chǎn)生量來確定酶活。具體方法如下：500 μL緩沖液+500 μL乳酸鈉（5 mmol/L）+100 μL酶液混勻，水浴保溫20 min；加入500 μL 0.1% DNP，水浴保溫10 min；加入500 μL 4 mol/L氫氧化鈉，水浴保溫10 min；510 nm比色讀值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。

酶活單位規(guī)定：1 min催化乳酸生成1 nmol丙酮酸的酶量為1個酶活力單位（U）。

乳酸氧化酶熱穩(wěn)定性測定方法：將純化后的酶液分別放置在水浴55℃、60℃中，分別處理5、10、20、30、60和90 min，最適條件下進(jìn)行活性檢測，以未經(jīng)熱處理的酶液作參照，計算剩余酶活百分比。

2 結(jié)果

2.1 EgLOD同源模建

EgLOD與綠色氣球菌（Aerococcus viridans）來源的乳酸氧化酶（PDB ID：4RJE）序列一致性達(dá)48.7%，相似性為53.2%，以4RJE為模板進(jìn)行單模板同源模建并經(jīng)能量最小化和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最后得到的蛋白結(jié)構(gòu)其拉氏構(gòu)象圖及Verify 3D驗證均達(dá)到可接受范圍。EgLOD是典型的黃素酶，蛋白結(jié)構(gòu)為（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)（圖1），輔酶FMN和底物乳酸鈉的結(jié)合位點在β折疊片C末端［12］。

圖1 乳酸氧化酶EgLOD的蛋白結(jié)構(gòu)及分子對接

圖2 FMN、乳酸鈉與EgLOD間的相互作用力

2.2 EgLOD分子對接及結(jié)構(gòu)分析

對接結(jié)果顯示輔酶FMN緊緊結(jié)合于EgLOD酶蛋白β折疊片C末端，底物乳酸同時與FMN和乳酸氧化酶蛋白作用。2D平面圖顯示受體氨基酸與配體FMN輔酶、乳酸鈉的相互作用力如圖2。FMN輔酶與乳酸氧化酶蛋白之間有多個相互作用的氨基酸殘基，形成了非常豐富的作用鍵網(wǎng)絡(luò)。對比乳酸鈉和FMN與蛋白分子形成作用的氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)有3個氨基酸殘基同時與兩個配體均有作用力，分別為Y37，H261，R264。而在觀察蛋白結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)有8個氨基酸位于EgLOD酶蛋白表面，分別為Y37、R179、Y211、K237、H261、H264、D292 和 R296。這些都是與催化密切相關(guān)的氨基酸，在ETSS計算后應(yīng)注意這些氨基酸的選擇。

2.3 EgLOD蛋白表面電荷計算

利用ETSS軟件計算EgLOD蛋白表面可電離的氨基酸殘基的總靜電勢能Eij，結(jié)果如圖3所示。帶電荷氨基酸殘基共有97個，其中42個氨基酸的總電勢能為正值，55個氨基酸的總電勢能為負(fù)值。

結(jié)合DS分子間作用力分析以及多序列比對結(jié)果（圖4），根據(jù)再設(shè)計4條原則進(jìn)行篩選，我們選擇了9個位點進(jìn)行改造，分別為D15、D44、D80、C124、E128、E242、D250、D267、D281。 突 變 方向為將Asp/Glu突變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相似但不帶電荷的Asn/Gln，將不帶電荷的Cys突變?yōu)閹д姾傻腍is。

圖3 ETSS軟件對EgLOD總靜電勢能Eij的計算結(jié)果

圖4 EgLOD與不同來源的乳酸氧化酶多序列比對

2.5 EgLOD野生型及其突變體的表達(dá)純化

測定酶活后發(fā)現(xiàn)，E242Q、D267N突變后失活，D15N、D44N、D80N、C124H、E128Q突變后酶活損失較大，因此著重對D250N、D281N進(jìn)行了詳細(xì)研究。EgLOD野生型及其突變體構(gòu)建成功后進(jìn)行表達(dá)，純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳驗證，結(jié)果如圖5所示。EgLOD野生型及其突變體純化后蛋白均呈單一條帶，大小在49 kD左右，與理論分子量一致。測定比活后發(fā)現(xiàn)，D250N、D281N的比活分別為36.7 U/mg、37.3 U/mg，與野生型38.0 U/mg相近，比活損失不大。

2.6 EgLOD野生型及其突變體的熱穩(wěn)定性測定

將純化后的EgLOD野生型及突變體置于55℃與60℃下，每隔一定時間測量其殘留活性，并規(guī)定未經(jīng)熱處理的酶活為100%，計算熱處理后剩余酶活的百分比，得到EgLOD野生型及突變體酶失活曲線，如圖6所示。突變體D250N溫度穩(wěn)定性最好，在60℃下放置30 min后，仍保持有62%的剩余酶活；D281N在60℃下放置30 min后，也可以保持有52%的剩余酶活；與之相比，野生型EgLOD保持約28%的殘留活性。

圖5 EgLOD野生型及其突變體的SDS-PAGE分析

圖6 乳酸氧化酶EgLOD野生型及突變體的溫度穩(wěn)定性

3 討論

目前國內(nèi)對于乳酸氧化酶熱穩(wěn)定性改造的研究非常少，只有少數(shù)研究在乳酸氧化酶的固定化時，發(fā)現(xiàn)可以同時提高其溫度穩(wěn)定性［17］。而國外通常使用易錯PCR［9］或DNA改組［18］等方式進(jìn)行隨機(jī)突變以及大量篩選來獲得有效的突變體，但是其中絕大多數(shù)突變體都是以損失酶催化活力為代價來提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的［9］。我們通過Discovery Studio軟件為乳酸氧化酶建模，并以此分析蛋白與輔酶以及底物的作用鍵網(wǎng)絡(luò)。我們發(fā)現(xiàn)由于乳酸氧化酶的蛋白結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，蛋白必須在輔酶FMN存在的條件下才能與底物發(fā)生催化反應(yīng)，而輔酶FMN與蛋白之間存在著復(fù)雜的作用鍵網(wǎng)絡(luò)，因此在對乳酸氧化酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性分子改造時，極易造成作用鍵網(wǎng)絡(luò)的破壞而導(dǎo)致蛋白酶活降低甚至失活。因此，探究一種既能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定，又不損失酶活的蛋白質(zhì)改造策略是非常有意義的。

電荷相互作用的優(yōu)化是一種成功應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的理性設(shè)計思路［19-20］，但國內(nèi)應(yīng)用該思路進(jìn)行蛋白改造的研究較少仍不成熟。本研究利用ETSS軟件，對EgLOD進(jìn)行熱穩(wěn)定性模擬改良，以期能提高EgLOD的穩(wěn)定性并擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。結(jié)合ETSS軟件的計算結(jié)果和再設(shè)計的4項原則，一共設(shè)計了9個突變體。經(jīng)過試驗驗證，D250和D281兩個氨基酸位點對提高EgLOD熱穩(wěn)定性起著非常重要的作用。在60℃下處理30 min后野生型EgLOD酶活僅剩20%左右，而D250N和D281N這兩個突變體在同等條件處理后仍然能夠保持50%以上的酶活，明顯提高了EgLOD的熱穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明降低蛋白表面的靜電勢能，能夠有效穩(wěn)定蛋白，確實證明蛋白表面帶電情況與蛋白穩(wěn)定性相關(guān)。

在酶工程中，對酶蛋白熱穩(wěn)定性改良的同時，保持酶活不損失是非常有必要的。本研究的主要目的是保證EgLOD酶活不損失的前提下進(jìn)行熱穩(wěn)定性改良。在比對突變體與野生型EgLOD的比活時發(fā)現(xiàn)，這兩個突變體的比活降低幅度很小，基本與野生型酶活相當(dāng)。這可能是因為我們在選取目標(biāo)位點時，在ETSS計算結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮了這些氨基酸殘基在蛋白結(jié)構(gòu)中的作用和它們的序列保守程度，盡量挑選遠(yuǎn)離活性位點和保守序列的氨基酸進(jìn)行突變。同時，本研究中我們將Asp突變?yōu)锳sn，這兩個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)相似，對于蛋白結(jié)構(gòu)的影響較小，因此突變體的比活沒有大幅降低。通過本實驗證實了通過表面電荷分布的優(yōu)化改造蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性是一種行之有效的策略。

4 結(jié)論

將ETSS計算與DS分子間作用力分析以及多序列比對相結(jié)合，對EgLOD進(jìn)行蛋白熱穩(wěn)定性改造，獲得了兩個有效突變體D250N和D281N，將60℃下放置30 min后的剩余酶活由野生型的28%分別提高至62%和52%，且其比活沒有損失。