田晶 徐小琳 康彥順 湯偉華 劉思琪

（石河子大學化學化工學院 新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，石河子 832003）

多 環(huán) 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指由2個及以上苯環(huán)組成的稠環(huán)芳香烴化合物，由于其毒性以及在環(huán)境中的持久性而受到廣泛關注［1-2］，美國環(huán)境保護署（EPA）已將16種PAHs列入優(yōu)先控制有機污染物黑名單中［3］。生物法去除多環(huán)芳烴主要通過生物的吸附、降解及兩種方式聯用去除環(huán)境中的多環(huán)芳烴。生物吸附能夠將PAHs快速從環(huán)境中去除，但仍然附著在吸附劑上，易產生二次污染；生物降解是通過各類酶催化降解PAHs為毒性較小或無毒的化合物，但處理周期長；而生物吸附和降解聯用先在短期內吸附大量PAHs，將其滯留在微生物體內，再利用微生物酶將PAHs完全降解，無二次污染。利用生物法去除多環(huán)芳烴因其經濟成本較低，可將污染物轉變?yōu)榈投净驘o毒的物質，對環(huán)境危害小，可操作性強，成為現今主要去除多環(huán)芳烴的方法之一。但生物法去除PAHs過程也受各種因素影響，如PAHs的化學性質、微生物的數量和種類及環(huán)境條件等［4］。

一般認為，PAHs的毒性隨著苯環(huán)數目的增加而增大。研究發(fā)現低分子量（2個或3個苯環(huán)）的PAHs（如萘、菲和蒽等）容易作為微生物生長所需的碳源和能源而被快速降解。而高分子量（4個及以上苯環(huán)）的PAHs（如芘、苯并蒽、屈、苯并芘和二苯并蒽等）較難被微生物降解。已發(fā)現可降解/轉化多環(huán)芳烴的微生物種類很多，包括細 菌， 如 假 單 胞 菌（Pseudomonas）［5］、 紅 球 菌（Rhodococcus）［6］、分支桿菌（Mycobacterium）［7］和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）［8］等；真菌，如白腐真菌（White Rot Fungi）［9-10］、青霉菌（Penicillium funiculosum）［11］、曲霉真菌（Aspergillus）［12］、鐮刀菌（Fusarium）［13］、毛霉菌（Mucor）［14］等 ；藻類，如羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）等［15-16］。由于絲狀真菌在減少土壤中高環(huán)多環(huán)芳烴的含量以及降低多環(huán)芳烴毒性方面具有獨特的優(yōu)勢，近年來得到了廣泛的關注，目前已知具有PAHs降解功能的真菌超過了220種［17］，在污染土壤修復中得到應用的也有30余種。與細菌相比，真菌能在低濕度、低pH的環(huán)境中生存，能對污染物保持較好的降解能力［18］。且真菌獨特的絲狀結構特征使其能夠適應特殊的生長環(huán)境，更易于在復合污染環(huán)境中存活［19］。目前，在污染土壤修復中主要研究的大多為白腐真菌和子囊菌門的盤菌亞門，其中白腐真菌還可修復其他有機污染或重金屬對土壤環(huán)境的污染，甚至可實現復合污染共脫毒［20］。此外，在多環(huán)芳烴降解研究中發(fā)現，細菌主要利用細胞色素（P450）單加氧酶降解多環(huán)芳烴［21-22］，而白腐真菌可同時利用胞內單加氧酶和胞外雙加氧酶（漆酶Laccase、木素過氧化物酶LiP和錳過氧化物酶MnP）降解PAHs。隨著真菌PAHs降解機制及真菌生態(tài)學研究的深入，真菌在污染（特別是復合污染）土壤修復中的潛在價值逐漸顯現［23］。

本實驗以蒽為唯一碳源和能源，從長期受污染的土壤中分離出一株黃曲霉（Aspergillus flavus sp.），并對黃曲霉菌降解PAHs特性以及不同耐受性進行研究，對微生物降解多環(huán)芳烴的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤采集 土壤采自新疆北部某化工廠周圍的土樣，將土壤表面大約5 cm的土層去掉，用滅過菌的鐵鏟采集5 cm-10 cm的土樣，然后裝入無菌的塑料袋中，密封后帶回實驗室于4℃保存?zhèn)溆?。土樣經除雜、碎散、過篩（0.85 mm）、混勻后密封儲存在塑料袋中，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，pH7，蒸餾水1 000 mL，用于菌種保藏。無機鹽培養(yǎng)基（MSM）：（NH4）2SO44.95 g，KH2PO40.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，無機鹽溶液2 mL，水1 000 mL，pH7。若是固體培養(yǎng)基則加入瓊脂20 g。添加不同濃度的PAHs用于菌株篩選。無機鹽溶液：MgSO4·7H2O 2 g，CuSO4·5H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.5 g，水 500 mL。PAHs固體培養(yǎng)基：PAHs-丙酮溶液（50 mg/L）均勻地噴涂于固體無機鹽培養(yǎng)基上，待丙酮揮發(fā)盡后備用。添加不同濃度的PAHs用于菌株篩選。（PAHs：蒽、菲、芘、苯并蒽、二苯并蒽（濃度＞97%）均購于阿拉丁工業(yè)公司）。PAHs儲備溶液：以丙酮為溶劑分別配制PAHs（1 g/L和5 g/L）的母液，將配制好的溶液置于冰箱中4℃保存?zhèn)溆茫≒AHs同上）。PAHs的標準溶液（作標準曲線用）：準確稱量PAHs標準試劑各0.005 0 g，用環(huán)己烷溶解，定容至50 mL（PAHs同上）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 取10 g采集的土樣加入90 mL已滅菌的蒸餾水中混勻，取5 mL加入50 mL無機鹽培養(yǎng)基中，在振蕩速度為150 r/min恒溫30℃的搖床中培養(yǎng)5 d后，從培養(yǎng)液中取出5 mL菌液加入到含蒽（50 mg/L）的無機鹽培養(yǎng)液中，培養(yǎng)5 d，富集培養(yǎng)幾個周期，至可以看到明顯的菌絲球形成。取0.1 mL菌液涂布于不同濃度（50、100、200、300和400 mg/L）的PAHs固體培養(yǎng)基中直至出現單菌落，挑取單菌落在斜面培養(yǎng)基上劃線，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的培養(yǎng) 將已純化的菌株接種至MSM液體培養(yǎng)基（50 mg/L）中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，分別測定7 d內菌株對蒽的去除率。

1.2.3 菌株鑒定 光學顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)，并將菌株送至上海生工生物工程技術服務有限公司完成18S rRNA測序。用BLAST軟件在GenBank上對獲得的18S rRNA序列進行同源性比對。利用MEGA軟件和Neighbor-Joining法，以比對結果和參考菌株序列及其他菌屬序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株的吸附與降解測定 菌株在無PAHs的MSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，分別取同批次的發(fā)酵液（包括活菌和培養(yǎng)液）、活菌絲（8 000 r/min離心10 min后去除上清液）、失活菌絲（高溫120℃，高壓1×105Pa，滅菌30 min）、發(fā)酵上清液（8 000 r/min離心10 min后取上清液）作為蒽去除劑，每組總反應體系20 mL（不足則補充滅菌的培養(yǎng)液），反應體系中蒽的濃度為50 mg/L，分別在1、2、3和6 h測定蒽的去除率。

1.2.5 蒽降解菌生長特性的研究 50 mL的三角瓶中裝20 mL MSM培養(yǎng)液（蒽濃度為50 m/L），接種量1 mL（培養(yǎng)24 h的菌懸液），在24、36、48、60和72 h測定蒽的去除率，依次優(yōu)化培養(yǎng)溫 度（25、30、35、40和 45℃）， 搖 床 振 蕩 培養(yǎng)（150 r/min）；搖床轉速（120、150、170和200 r/min）恒溫振蕩培養(yǎng)；起始pH值（4、5、6、7、8和9）以不接種的培養(yǎng)基對照，每個處理設3個重復。

1.2.6 降解菌的耐受性測定

1.2.6.1 菌株對蒽的耐受性 在MSM培養(yǎng)基中加入蒽-丙酮溶液，調節(jié)蒽的質量濃度分別為50、100、200、400、800和1 000 mg/L。50 mL 的三角瓶中裝20 mL培養(yǎng)液，接種量1 mL（培養(yǎng)24 h的菌懸液），最優(yōu)條件下培養(yǎng)72 h測定蒽的去除率。以不接種的培養(yǎng)基對照，每個處理設3個重復。

1.2.6.2 不同鹽濃度下菌株對蒽的降解 在MSM培養(yǎng)基（蒽濃度為50 mg/L）中加入NaCl濃度分別為1%、3%、5%、6%、7%和9%。最優(yōu)條件下培養(yǎng)72 h后測定蒽的去除率。以接種在原培養(yǎng)基的菌株去除率為對照，實驗設接菌不加鹽對照，每個處理設3個重復。

1.2.6.3 不同重金屬濃度下菌株對蒽的降解 在MSM培養(yǎng)基中分別加入濃度為1、2、3、4和5 mmol/L的5種重金屬離子Cu2+、Mn2+、Cr3+、Cd2+和Pb2+，最優(yōu)條件下培養(yǎng)72 h后測定蒽的去除率。以接種在原培養(yǎng)基的菌株去除率為對照，每個處理設3個重復。

1.2.6.4 菌株的底物廣譜性 分別配置50mg/L的蒽、菲、芘、苯并蒽和二苯并蒽，50 mL 的三角瓶中分別裝20 mL MSM培養(yǎng)液（多環(huán)芳烴濃度為50 mg/L，接種量1 mL（培養(yǎng)24 h的菌懸液），72 h后測定多環(huán)芳烴的去除率，以加不同底物不接菌的培養(yǎng)基為對照，每個處理設3個重復。

1.2.7 多環(huán)芳烴去除率的測定

1.2.7.1 蒽的標準曲線 配置10 mg/L蒽的標準溶液， 分 別 取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mL并定容至10 mL，分別再λ=254 nm的波長下測其吸光度值，最后得到蒽的標準曲線方程為：Y=1.232 9 X-0.000 1，R2=0.999 9。

1.2.7.2 去除率的測定 培養(yǎng)液用環(huán)己烷1∶1體積比在125 mL 梨形分液漏斗中反復萃取3次，合并有機相，經無水Na2SO4脫水后定容［24］。萃取液經適當稀釋后，在254 nm處測定其吸光值，根據蒽的標準曲線，得出蒽的濃度。

去除率：（D）

C0：空白對照蒽的濃度；C1：培養(yǎng)液中殘留蒽的濃度。

2 結果

2.1 菌株的篩選與鑒定

以蒽為唯一碳源和能源進行篩選，對富集培養(yǎng)后的菌株進行純化，挑取單菌落至新的平板上進行培養(yǎng)觀察，所篩選得到的菌株菌落結構疏松，表面顏色呈淡黃色，有復雜的分支菌絲（圖1-A），在顯微鏡下觀察可見分生孢子頭疏松放射狀，頂囊近似球形，粗糙（圖1-B和1-C）。提取蒽降解菌株基因組總DNA后，經PCR擴增18S rRNA得到1 275 bp大小的擴增片段，擴增后的DNA片段經過純化測序，并在GenBank中與相似性較高的菌株進行比對、構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，蒽降解菌株與黃曲霉屬的相似性最高（圖2），命名為黃曲霉AD-X-1（Aspergillus flavus AD-X-1）。

圖1 所篩菌株的菌落照片及顯微照片

圖2 篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

考察所篩選菌株AD-X-1的生長曲線及對蒽（50 mg/L）的去除，結果如圖3所示，菌株AD-X-1在蒽存在時生長相對較慢，144 h左右菌株AD-X-1達到穩(wěn)定期，此時的生物量達到最大（0.8 g/L），蒽的去除率為85%左右。該菌株的去除率與菌株生長成正比，后期實驗僅考察72 h內的去除率。

圖3 菌株AD-X-1的去除率及生長曲線

2.2 菌株對多環(huán)芳烴去除方式研究

真菌因其巨大的比表面積和眾多的附著位點，有利于對疏水性VOCs攝取和利用，真菌對有機污染的去除有多種形式，包括吸附、降解和吸附降解共同作用。為確定菌株AD-X-1對多環(huán)芳烴的去除方式，在不同處理條件下考察菌株AD-X-1對蒽的去除。結果如圖4所示，失活菌絲在1 h時可達吸附平衡，去除率在21%左右，說明失活菌絲吸附已經達到飽和。相比較，菌株AD-X-1的發(fā)酵液、活菌絲、發(fā)酵上清液的去除率隨時間延長而持續(xù)增加，在6 h時去除率分別可達47%、25%和12%。表明菌株ADX-1除菌絲體吸附外，還有別的方式進行蒽的去除，隨著菌株與底物的接觸，菌株自身產生的酶或者大分子活性物質開始參與蒽的降解，且6 h總去除率已超過吸附作用的去除率。前期測得該菌株72 h蒽的去除能力可達到70%左右（圖3），說明菌株ADX-1去除蒽的方式主要還是以降解為主。

2.3 菌株AD-X-1的生長特性

分別研究不同溫度、轉速、pH值下菌株ADX-1對蒽的去除，結果顯示，35℃培養(yǎng)72 h，去除率最高達76%，菌體干重為0.85 g/L（圖5-A）。45℃時菌株AD-X-1的去除率仍能維持在65%左右。

在35℃，轉速為170 r/min培養(yǎng)72 h，菌株ADX-1對蒽的去除率可達到78%（圖5-B），菌株生長較快，去除效果較好。

pH是影響微生物生長的關鍵因素，在極端pH下，微生物生長變慢，活性降低。在35℃，轉速170 r/min，pH為7培養(yǎng)72 h，菌株AD-X-1的去除率最高（88%）；然而在pH為9時，菌株AD-X-1的去除率還能維持在45%左右（圖5-C）。說明菌株在堿性環(huán)境（pH7-9）中具有一定的耐受性。

圖4 不同處理下菌株AD-X-1對蒽的吸附與降解

2.4 菌株AD-X-1的耐受性研究

2.4.1 菌株AD-X-1對蒽的耐受性 在MSM培養(yǎng)基中添加不同濃度的蒽，考察菌株AD-X-1對蒽的耐受性。結果如圖6所示，隨著蒽的濃度增加，菌株的去除率在72 h后逐漸降低，但蒽濃度為1 000 mg/L時仍有55%的去除率，說明該菌株對高濃度蒽的耐受性較強，可在高污染環(huán)境中生存。

2.4.2 菌株AD-X-1的耐鹽性 考察菌株AD-X-1對鹽的耐受性，結果如圖7所示。菌株AD-X-1在1%-9%的鹽度內對蒽均有一定的去除作用，當鹽度為1%，對菌株去除蒽幾乎無影響，72 h蒽的去除率可達90%；當鹽度為3%-5%時，72 h菌株對蒽的去除率下降至78%左右；當鹽度在6%-9%時，去除率下降較快，但還能維持在50%左右，表明該菌株對鹽度的耐受力較強，但高鹽度會引起細胞滲透壓的升高，還是對菌株的生長和有機污染物的去除有一定抑制。

2.4.3 菌株AD-X-1對重金屬的耐受性 選擇Cu2+、Mn2+、Cr3+、Cd2+和Pb2+幾種常見重金屬，考察重金屬離子對菌株生長和污染物去除的影響。單獨添加1 mmol/L各種重金屬離子時，除Cu2+外，菌株ADX-1對蒽的去除能力均受到一定抑制（圖8）。隨著重金屬離子濃度繼續(xù)增加時，菌株對蒽的去除率大幅下降。對比5種金屬離子，低濃度的Cu2+對菌株去除能力影響不大，其他重金屬離子均對該菌株有一定影響，該菌株對五種重金屬離子的耐受能力由大到小順序為 Cu2+、Cr3+、Pb2+、Mn2+和 Cd2+。

圖5 不同溫度（A）、轉速（B）、pH值（C）對菌株ADX-1去除率的影響

2.5 菌株AD-X-1的底物廣譜性

分別以不同環(huán)數的PAHs為底物，考察菌株AD-X-1對其去除能力。結果（圖9）顯示，除蒽（An）以外，菌株AD-X-1還能去除菲（Phe）、芘（Pyr）、苯并蒽（BaA）、二苯并蒽（DBA）等多種PAHs。培養(yǎng)72 h后菌株AD-X-1對三環(huán)的蒽和菲去除率可達到70%以上，對于四環(huán)的芘和苯并蒽的去除率可達68%左右，對五環(huán)的二苯并蒽去除率仍可達到63%。說明菌株AD-X-1不僅能夠去除低環(huán)的PAHs還可去除高環(huán)的PAHs，可去除的底物多樣。

圖6 不同濃度的蒽對菌株AD-X-1去除率的影響

圖7 鹽度對菌株AD-X-1去除率的影響

圖8 不同金屬離子對菌株AD-X-1去除率的影響

圖9 菌株AD-X-1對不同PAHs的去除率

3 討論

本研究從新疆北部某化工廠周圍的土樣篩選獲得一株具有廣譜性多環(huán)芳烴降解菌株AD-X-1，通過鑒定為黃曲霉屬。進一步考察溫度、轉速、pH值對蒽（50 mg/L）去除的影響，結果在最優(yōu)條件（溫度35℃，轉速170 r/min，pH值為7）下，72 h后菌株AD-X-1對蒽的去除率可達到88%，是一株降解效果較高的真菌。由于真菌細胞壁上存在大量的功能基團，如羥基、羧基、氨基、磺酸鹽和磷酸鹽基團等，這些基團賦予真菌良好的吸附性能［26］。在吸附降解實驗中失活菌絲在1 h即達到吸附平衡，去除率在前3 h相比于活菌絲吸附能力高，可能由于高溫高壓滅活過程中，菌絲內部結構被破壞，增大了其表面通透性和吸附性。而菌株AD-X-1的發(fā)酵液、活菌絲、發(fā)酵上清液的去除率隨時間增加而增加，表明除吸附作用外，菌株自身所產生的酶類（實驗中檢測到胞外錳過氧化物酶、木質素酶活性，數據未顯示）參與蒽的降解。所以菌株AD-X-1對多環(huán)芳烴的去除是以降解為主，菌絲體吸附也起到一定作用。

近年來，國內外對高分子量PAHs的微生物降解研究表明，能夠同時降解多種高分子量PAHs（如四環(huán)和五環(huán)）的微生物資源較少［27］。王慧等［28］篩選出嗜鹽菌Thalassospira sp.strain TSL5-2能夠降解三環(huán)和四環(huán)的多環(huán)芳烴。段燕青等［29］篩選出的米曲霉以芘為單基質代謝時，降解率為33%；毛健等［27］篩選的菌株HPD-2在培養(yǎng)168 h后對芘和熒蒽的去除率分別達到47.2%和84.5%。朱婷婷等［30］篩選出的一株不動桿菌Bap30在20 d內才將40 mg/L的苯并［a］芘降解28.7%。本實驗所篩選的菌株ADX-1在72 h內對蒽（50 mg/L）和菲（50 mg/L）去除率分別為88%和70%，對四環(huán)的芘和苯并蒽的去除率可到71%和68%，菌株AD-X-1對五環(huán)的二苯并蒽降解能力也可達到63%。說明菌株AD-X-1具有高效、廣譜的多環(huán)芳烴降解能力。

已有研究發(fā)現，適當的鹽度可促進菌株的降解，而高鹽度卻會抑制降解菌的生長、降解和代謝［31］。王慧等［28］從石油污染土壤中富集分離出的嗜鹽菌Thalassospira sp.strain TSL5-2最適鹽度為5%，25 d內降解率達到53.3%。李修平［32］篩選出的蒽降解菌A1鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）在72 h，鹽濃度為1.2%時的降解率最大為78%。而菌株AD-X-1在鹽濃度為1%時，72 h的去除率最大可達90%，在5%的鹽度下，菌株72 h的去除率可達78%。相比于上述兩株菌，AD-X-1的降解效果較好而且降解時間短。也說明菌株AD-X-1對鹽具有較高的耐受性。

研究發(fā)現，重金屬可加劇多環(huán)芳烴對微生物細胞的毒害作用［29］，然而在土壤環(huán)境中多存在重金屬和多環(huán)芳烴的復合污染?？疾炀闍D-X-1對重金屬離子（1 mmol/L）的耐受性，72 h在Cu2+（249.69 mg/L）、Cd2+（308.48 mg/L）、Pb2+（331.21 mg/L）存在時，菌株的去除率就可達90%、40%和60%，對Cr3+（400.05 mg/L）和Mn2+（169.02 mg/L）的去除率可達54%和72%。當重金屬離子濃度達到3 mmol/L時，菌株的去除率下降很快。相比較，菌株AD-X-1對Cu2+的耐受性最強，對Cd2+的耐受性最差（圖8）。顧平等［33］發(fā)現在 Cu2+（50 mg/L）存在時菌株BF-1對B［a］P的降解作用略有下降，降解率為64.77% ；Cd2+（100 mg/L）和 Pb2+（300 mg/L）會明顯降低菌株BF-1對B［a］P的降解效果，降解率分別為54.07%和49.59%。段燕青等［29］研究了米曲霉對重金屬（銅和鎘）的耐受濃度分別為500 mg/L和50 mg/L，菌株還能生長。相較而言，菌株AD-X-1對不同重金屬的耐受能力較強。因此本研究篩選所獲得的菌株AD-X-1具有廣譜的多環(huán)芳烴降解能力，還具有很好的耐鹽、耐重金屬特性，說明該菌株能更好的適應較為惡劣的環(huán)境。

4 結論

從受污染的土壤中篩選得到1株多環(huán)芳烴高效降解菌，經18S rRNA鑒定此菌株為黃曲霉屬，命名為Aspergillus flavus. AD-X-1。

菌株AD-X-1對多環(huán)芳烴的去除以降解為主，菌絲體吸附也起到一定作用。通過優(yōu)化蒽濃度為50 mg/L時，在溫度35℃，轉速170 r/min，pH值7時，72 h菌株AD-X-1對蒽的去除率可達到88%。

菌株有較好的耐受惡劣環(huán)境的特性，當鹽度為9%時，菌株對蒽的去除率仍保持在50%；對重金屬離子有較好的耐受性（Cu2+＞Cr3+＞ Pb2+＞ Mn2+＞Cd2+）；且除蒽、菲外，該菌株還可去除四環(huán)的芘和苯并蒽、五環(huán)的二苯并蒽，底物多樣。