吉米拉木·加馬力 古海尼沙·買(mǎi)買(mǎi)提 柔鮮古麗·乃再爾帕孜來(lái)提·拜合提

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

地衣是研究重金屬元素大氣沉降特征的良好材料，一直以來(lái)可作為監(jiān)測(cè)大氣及土壤重金屬污染物的一種有效指示劑。由于地衣體不具有高等植物所具有的真皮層和蠟質(zhì)層，環(huán)境中的污染物質(zhì)很容易進(jìn)入并聚集在地衣體內(nèi)，并對(duì)其產(chǎn)生傷害。有些地衣種類(lèi)的重金屬濃度遠(yuǎn)高于外界環(huán)境，銅含量高達(dá)其干重的5%，對(duì)于其他生物而言，這個(gè)濃度遠(yuǎn)超于它們的耐受性［1-3］。1982年，Goyal等［4］發(fā)現(xiàn) 2種地卷屬地衣（Peltigera canina和Peltigera rufescens）以地衣體變小、假根變短、地衣體顏色變暗等方式適應(yīng)富含重金屬的生長(zhǎng)環(huán)境；2006年，Monnet等［5］研究報(bào)道，0.25 mmol/L銅處理?xiàng)l件下，對(duì)地衣Dermatocarpon luridum活性沒(méi)有影響，而且地衣抗氧化酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，超量銅（大于0.50 mmol/L）處理?xiàng)l件下，Dermatocarpon luridum地衣抗氧化酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；2006年Backor等［6］發(fā)現(xiàn)，較高濃度的Cu脅迫導(dǎo)致GSH顯著降低，可能是由于重金屬誘導(dǎo)的谷光甘肽（Glutathione，GSH）氧化為谷胱甘肽二硫化物（GSSG），因此表現(xiàn)出地衣Cladonia cristatella對(duì)銅脅迫下的響應(yīng)；2007年 Purvis等［7］研究發(fā)現(xiàn) Lecanora polytropa為銅超富集性地衣；2008年Dzubaja等［8］發(fā)現(xiàn)地衣Xanthoria parietina 對(duì)重金屬污染具有較高的耐性；Hauck等［9-10］研究報(bào)道，地衣體重金屬脅迫下，地衣提取物的結(jié)合重金屬的作用不是很明顯；銅脅迫對(duì)地衣Evernia prunastri生理生化特征的影響，即隨著銅濃度的增加地衣Evernia prunastri響應(yīng)銅脅迫的抗氧化物含量增加，類(lèi)胡蘿卜素、葉綠素a、可溶性蛋白等含量減少［11］。2009年 Backor等［12］通過(guò)對(duì)廢棄銅礦周?chē)缓~基物表面生長(zhǎng)的2種地衣（地卷Peltigera rufescens和鹿蕊Cladina arbusla）的元素含量、光系統(tǒng)活性、自由氨基酸及蛋白質(zhì)含量等進(jìn)行了研究，了解了這些地衣對(duì)富含銅基質(zhì)的生理適應(yīng)性的特點(diǎn)。在國(guó)內(nèi)，2015年熱依拉等［13］研究指出，不同濃度（1-4 mmol/L）Cu2+處理對(duì)地卷共生藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯的影響，在所有處理?xiàng)l件下，地卷共生藻細(xì)胞壁、細(xì)胞膜均完整，且大多數(shù)共生藻細(xì)胞處于分裂狀態(tài)，地卷對(duì)銅脅迫具有一定的耐性。

谷胱甘肽作為生物體內(nèi)主要的還原肽之一，在生物體抵抗重金屬脅迫中起著重要的調(diào)節(jié)作用，逆境條件下生物促進(jìn)GSH的生物合成并保持較高的含量，通過(guò)增強(qiáng)膜蛋白的穩(wěn)定性，發(fā)揮重要的抗氧化和整合重金屬離子而起解毒作用，提高生物對(duì)逆境的耐性［14-17］。

隨著工業(yè)化引起的重金屬污染，生物重金屬耐性及其機(jī)制研究以及耐性生物在環(huán)境重金屬污染修復(fù)和治理中的應(yīng)用引起國(guó)內(nèi)外科研人員的廣泛關(guān)注，其中，植物抗逆脅迫研究最多［18-21］，與真菌相比，藻類(lèi)的逆境脅迫研究報(bào)道較少［22-24］，而地衣這類(lèi)特殊生物的重金屬脅迫及其機(jī)制研究報(bào)道更為罕見(jiàn)［25］。為了探討菌藻共生的特殊生物地卷響應(yīng)銅離子脅迫的差異及谷胱甘肽在低等生物地衣抗重金屬脅迫中的作用，本研究以3種地卷為研究對(duì)象，首次對(duì)Cu2+脅迫下地卷GSH含量的變化進(jìn)行研究，分析逆境脅迫環(huán)境條件下，地衣體誘導(dǎo)產(chǎn)生的GSH變化與地卷細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面吸收銅之間的相關(guān)性，以探討GSH緩解地衣重金屬脅迫中的作用，為進(jìn)一步探索地衣重金屬脅迫耐性的機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3種地衣即地卷（Peltigera rufescens）、平盤(pán)軟地 卷（Peltigera elisabethae） 和 犬 地 卷（Peltigera canina），2014年10月采集于烏魯木齊米泉林場(chǎng)哈熊溝，海拔高度為1 960-2 100 m。分類(lèi)鑒定的地衣標(biāo)本-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 Cu2+脅迫對(duì)地卷屬3種地卷谷胱甘肽含量的影響 以2種地衣即地卷和平盤(pán)軟地卷為主要研究材料，用4種不同的方法（熱水抽提法、乙醇抽提法、超聲波乙醇抽提法和超聲波水抽提法）提取地衣體的 GSH 進(jìn)行測(cè)定［26］。

不同濃度CuSO4脅迫處理3種地卷，選最佳GSH提取方法分離提取GSH，研究Cu2+脅迫對(duì)3種地卷GSH含量的影響。具體操作如下：準(zhǔn)備空培養(yǎng)皿放入濾紙，濾紙上噴灑不同濃度（1、2、3、4、5、6、7和8 mmol/L）的CuSO4溶液10 mL，每種質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，蒸餾水作為對(duì)照。從采集樣本中篩選出新鮮、大小相等的地衣體材料（地卷、平盤(pán)軟地卷和犬地卷）用蒸餾水清洗地衣體表面的雜物后，分別放入以上噴灑CuSO4的濾紙上，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，18-20℃放置6、12、18和24 h后，用蒸餾水洗滌地卷上的CuSO4溶液，濾紙吸干后放入烘箱烘干，然后研磨成粉末狀態(tài)，分離提取GSH，λ412nm測(cè)定吸光度。

1.2.2 地卷Cu2+吸收性的研究 將地衣體用10 mL的20 mmol/L Na2-EDTA反復(fù)沖洗20 min，然后10 mL的去離子水沖洗20 min，2次沖洗的溶液混合在一起用吸附于細(xì)胞表面的銅含量測(cè)定；外表面沖洗后的地衣體，90℃烘干12 h，用研磨體研磨成粉狀備用。烘干的地衣體加入消化液（6 mL的65%HNO3加3 mL的30%過(guò)氧化氫后蒸餾水定容至10 mL）90℃消化12 h，定容至10 mL，離心過(guò)濾去處殘?jiān)?，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)銅含量，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。1.2.3 測(cè)定指標(biāo) 采用DTNB法［26］（分光光度計(jì)，λ412nm）進(jìn)行GSH含量測(cè)定，用μg/mg表示。用火焰原子吸收原子吸收法［27］測(cè)定銅含量，用μg/mg表示。1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010 及SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與方差分析和（0.05和0.01水平）多重比較。

2 結(jié)果

2.1 地衣體中GSH提取方法及GSH含量測(cè)定方法

過(guò)量的DTNB溶液中最大吸收波長(zhǎng)（λ412nm）處的吸光度與GSH濃度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.014 4x-0.003，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 5。

用4種方法分別從地卷和平盤(pán)軟地卷提取GSH并測(cè)定含量（圖1），發(fā)現(xiàn)無(wú)論哪種方法，對(duì)地卷GSH含量的幾乎無(wú)影響，差異不顯著（P＞0.05）；而平盤(pán)軟地卷中，超聲波乙醇提取法所提取的GSH含量最高（P＜0.01），此方法操作簡(jiǎn)單，適合實(shí)驗(yàn)室操作，因此，確定該方法為地衣體內(nèi)提取GSH的首選方法。

圖1 各種提取方法的比較

2.2 Cu2+濃度脅迫對(duì)3種地卷GSH含量的影響

如圖2所示，3種地衣分別用不同濃度Cu2+（1-8 mmol/L）處理24 h后，GSH含量的變化具有一定的差異。Cu2+濃度≤4 mmol/L時(shí)，隨著脅迫濃度的提高，3種地卷的GSH含量均逐步增加，4 mmol/L時(shí)到達(dá)最高值，地卷和犬地卷的GSH含量，與對(duì)照相比，分別增加了6.08和6.62倍，Cu2+濃度（≥5 mmol/L）時(shí)，才開(kāi)始出現(xiàn)明顯的下降，但GSH含量均高于對(duì)照組（P＜0.05）。平盤(pán)軟地卷自身具有較高的GSH，Cu2+濃度為4 mmol/L時(shí)，與對(duì)照相比，僅增加了1.7倍，Cu2+濃度3-5 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，GSH含量變化差異不顯著，Cu2+濃度（≥6 mmol/L）開(kāi)始較明顯的下降（P＜0.05）?；诒狙芯拷Y(jié)果結(jié)合前期研究結(jié)果［13］，可初步確定3種地卷的銅耐受性范圍為4-5 mmol/L并在4 mmol/L Cu2+脅迫下，不同處理時(shí)間對(duì)GSH含量的影響進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 不同濃度Cu2+脅迫對(duì)3種地卷地衣體內(nèi)GSH含量的影響

2.3 4 mmol/L Cu2+脅迫下，不同處理時(shí)間對(duì)3種地卷GSH含量的影響

4 mmol/L Cu2+脅迫下處理不同時(shí)間時(shí)，地卷和平盤(pán)軟地卷的GSH含量的變化趨勢(shì)類(lèi)似，出現(xiàn)波動(dòng)性變化；處理時(shí)間為6 h時(shí)GSH含量略有增加，增加量分別為對(duì)照的1.58和1.56倍；處理時(shí)間延長(zhǎng)到12 h時(shí)，GSH含量不再繼續(xù)上升卻出現(xiàn)一定量的下降；處理時(shí)間＞16 h時(shí)，GSH含量重新又表現(xiàn)為逐步上升趨勢(shì)，18-24 h含量基本穩(wěn)定，24 h時(shí)達(dá)到最高值（分別為對(duì)照的6.07和1.73倍）。犬地卷中，4 mmol/L Cu2+脅迫處理時(shí)間6 h時(shí)，GSH增加量最明顯并呈逐步增加趨勢(shì)，24 h到最高值（為對(duì)照的6.32倍）（圖3）。3種地卷響應(yīng)重金屬脅迫使最高GSH含量的Cu2+濃度為4 mmoL/L，但處理時(shí)間的不同，GSH含量的變化趨勢(shì)存在差異。

圖3 Cu2+脅迫下處理時(shí)間對(duì)幾種地卷GSH含量的影響

表1 不同Cu2+濃度脅迫下3種地卷胞內(nèi)、外銅含量的影響

2.4 3種地卷屬地衣Cu2+吸附能力的研究

通過(guò)對(duì)不同濃度Cu2+脅迫下3種地卷細(xì)胞表面銅含量的測(cè)定（表1），其吸附能力隨著濃度的提高而增加（P＜0.01），Cu2+濃度4 mmol/L時(shí)達(dá)最高值，與對(duì)照相比，分別增加了3568、55.27和4 413倍。3種地卷隨濃度的增加細(xì)胞內(nèi)所吸收銅含量的變化卻有所差異：地卷中隨Cu2+濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)所吸收銅含量的變化呈高-低-高的趨勢(shì)，Cu2+濃度2 mmol/L時(shí)到最高值（為對(duì)照的381.4倍），3 mmol/L時(shí)稍微減少后繼續(xù)增加。平盤(pán)軟地卷中隨Cu2+濃度的增加細(xì)胞內(nèi)所吸收銅含量的變化呈高-低-高的趨勢(shì)，2 mmol/L時(shí)略下降后繼續(xù)增加，4 mmol/L到最高值（為對(duì)照的7.52倍）。犬地卷中隨Cu2+濃度的增加細(xì)胞內(nèi)所吸收銅含量的變化呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，Cu2+濃度2 mmol/L時(shí)到最高值（為對(duì)照的6 528.7倍），3-4 mmol/L時(shí)細(xì)胞內(nèi)所吸收銅含量有所下降，但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。平盤(pán)軟地卷對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)就具有較高含量的銅，并且細(xì)胞內(nèi)所吸收銅含量的變化不如地卷和犬地卷明顯。

2.5 不同時(shí)間Cu2+脅迫下3種地卷屬地衣銅吸附性

2 mmol/L Cu2+濃度脅迫處理?xiàng)l件下，隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3種地卷的細(xì)胞內(nèi)所吸收的銅含量和吸附于細(xì)胞外表面的銅含量的變化存在一定的差異。

2.5.1 細(xì)胞內(nèi)所吸附的銅含量變化 地卷和平盤(pán)軟地卷細(xì)胞內(nèi)銅含量呈先升后下降趨勢(shì)；12 h時(shí)地衣體吸收銅含量達(dá)到最高值，與對(duì)照相比較分別增加44.40倍和3.95倍；不同與其它兩種地卷，犬地卷所吸收的銅含量變化呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，24 h時(shí)到最高值，與對(duì)照相比較增加6.52倍（P＜0.01）。

2.5.2 卷細(xì)胞外表面所吸附的銅含量變化 平盤(pán)軟地卷和犬地卷細(xì)胞外表面吸附銅含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐步上升，24 h時(shí)到最高值，與對(duì)照相比較分別增加41.64和71.67倍，增加量非常顯著，地卷細(xì)胞外表面吸附的銅含量變化不同于前2種地卷呈先升高后下降趨勢(shì)，6 h時(shí)就達(dá)最高值，且增加量非常顯著，與對(duì)照相比較增加2 434倍（表2）。

4 mmol/L Cu2+濃度脅迫條件下，隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3種地卷的細(xì)胞內(nèi)所吸收的銅含量和吸附于細(xì)胞外表面的銅含量的變化也存在差異。

（1）細(xì)胞內(nèi)所吸收的銅含量的變化趨勢(shì)：隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，地卷細(xì)胞內(nèi)的銅含量呈先上升后下降趨勢(shì)，12 h到最高值（為對(duì)照的442.20倍）；平盤(pán)軟地卷胞內(nèi)銅含量表現(xiàn)為逐步增加，達(dá)12 h有一定下降后繼續(xù)增加，24 h達(dá)最高值（為對(duì)照的7.52倍，P＜0.01）；犬地卷的細(xì)胞內(nèi)銅含量也逐步增加，24 h達(dá)最高值（為對(duì)照的5.77）。3種地卷中侵入細(xì)胞內(nèi)的銅含量的變化出現(xiàn)先升高，后下降的趨勢(shì)，很可能與細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)代謝途徑或酶活性的銅離子解毒作用密切相關(guān)。Cu2+脅迫下，不同處理濃度和不同處理時(shí)間下，3種地卷谷胱甘肽含量的變化趨勢(shì)（圖2，圖3）與細(xì)胞內(nèi)銅含量的波動(dòng)性變化較吻合，說(shuō)明高等植物中參與重金屬誘導(dǎo)有害物質(zhì)清除的谷胱甘肽（生物抵御脅迫響應(yīng)的重要指標(biāo)之一），在地衣這種菌藻共生的地等生物中也發(fā)揮重金屬解毒作用，以緩解重金屬脅迫對(duì)生物體的毒害作用。

（2）吸附于細(xì)胞外表面的銅含量的變化趨勢(shì)：地卷吸附于細(xì)胞外表面的銅含量6 h內(nèi)迅速增加到最高值（為對(duì)照的5 017倍），6-12 h內(nèi)有一定的下降后繼續(xù)增加（P＜0.01）；平盤(pán)軟地卷細(xì)胞外表面銅含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步增加趨勢(shì)，24 h到最高值（對(duì)照的41.69倍，P＜0.01）；犬地卷中脅迫處理時(shí)間12 h時(shí)，吸附于細(xì)胞外表面的銅含量有一定下降后繼續(xù)增加，24 h達(dá)最高值（為對(duì)照的139.21倍，P＜0.01）（表2）。研究結(jié)果顯示，銅離子脅迫條件下，地卷屬3種地衣吸附于細(xì)胞外表面的銅含量顯著高于細(xì)胞內(nèi)所吸收的銅含量，可見(jiàn)地卷盡可能將重金屬離子銅吸附于細(xì)胞外表面，而阻止其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，響應(yīng)重金屬脅迫對(duì)生物體產(chǎn)生的傷害。

表2 Cu2+脅迫下不同時(shí)間對(duì)3種地衣細(xì)胞內(nèi)、表面銅含量的影響

3 討論

銅是生物生長(zhǎng)所需的微量元素之一，對(duì)綠色植物體的光合作用、細(xì)胞的呼吸作用、細(xì)胞代謝、細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)等方面起著主要的作用［28-29］，但當(dāng)生物銅含量一旦超過(guò)閾值就會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒害作用，也是造成生態(tài)環(huán)境污染的主要污染物。銅對(duì)植物造成毒害的同時(shí)，植物也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的解毒機(jī)制，如GSH和植物絡(luò)合素（PCs），在植物對(duì)重金屬解毒過(guò)程中合成的重要含巰基化合物［30］。GSH是植物金屬螯合態(tài)（PCs）的直接前提，這些PCs可以與重金屬形成螯合物轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)隔離［31-32］；生物體在逆境條件下保持較高含量的GSH含量，有效地還原植物細(xì)胞中-S-S-鍵，加強(qiáng)膜蛋白的穩(wěn)定性，提高植物對(duì)逆境的抗性和適應(yīng)性［33］。GSH在地衣這類(lèi)低等生物抗重金屬脅迫中的作用罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以3種地卷為主要研究對(duì)象，主要對(duì)不同濃度銅脅迫處理不同時(shí)間下，吸附于地衣體細(xì)胞外表面的銅含量和細(xì)胞所吸收的銅含量與地衣體谷胱甘肽含量變化的相關(guān)性進(jìn)行研究，以確定谷胱甘肽在地衣生物抵抗重金屬脅迫的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重金屬脅迫下3種地卷屬地卷銅吸附能力和GSH含量的變化之間確實(shí)存在一定的相關(guān)性；未經(jīng)銅離子脅迫處理的對(duì)照組中，地卷和犬地卷中細(xì)胞內(nèi)含有極微量銅（胞外銅含量為零），GSH含量也很低，1 mmol/L Cu2+脅迫條件下，地卷和犬地卷細(xì)胞內(nèi)所吸收的銅含量迅速上升，GHS含量也出現(xiàn)迅速增加（分別為對(duì)照的3.92和3.28倍）；隨著脅迫濃度的增加（≥2 mmol/L），地卷和犬地卷細(xì)胞內(nèi)銅含量沒(méi)有出現(xiàn)繼續(xù)增加，反而略有下降趨勢(shì)并仍高于對(duì)照組，GSH含量卻隨著脅迫濃度的提高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，當(dāng)4 mmol/L Cu2+脅迫處理時(shí)，地卷中細(xì)胞內(nèi)銅含量和GSH含量6 h就迅速增加（分別為照的1 126和4.64倍），隨后基本穩(wěn)定，犬地卷隨時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的GSH含量和銅含量逐步增加，說(shuō)明GSH可能與細(xì)胞所吸收銅的解毒密切相關(guān)。與同樣生境采集的地卷和犬地卷不同，平盤(pán)軟地卷對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)（245 μg/g）和胞外（75.5 μg/g）均具有較高含量的銅和細(xì)胞內(nèi)的GSH含量（0.823 6 μg/mg），隨著脅迫濃度的增加，平盤(pán)軟地卷細(xì)胞內(nèi)GSH含量也呈現(xiàn)逐步增加。研究表明，重金屬脅迫下，植物GSH含量與還原酶活性顯著升高［34］，Cu2+濃度（1-4mmol/L）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)銅含量的增加會(huì)促進(jìn)的GSH的誘導(dǎo)合成；濃度繼續(xù)增加超過(guò)地衣體耐受能力時(shí)，雖然GSH含量逐步下降仍然高于對(duì)照組（P＜0.05），表明細(xì)胞內(nèi)銅富集和GSH含量變化之間存在正相關(guān)性關(guān)系，在抵御逆境脅迫過(guò)程中，菌藻共生的特殊生物——地卷類(lèi)似高等植物可誘導(dǎo)合成GSH緩解Cu2+脅迫對(duì)地衣體的毒害作用，因此不同地衣物種誘導(dǎo)合成GSH的能力和銅吸附性之間的相關(guān)性研究可作為評(píng)價(jià)其響應(yīng)Cu2+脅迫差異的重要參考指標(biāo)之一。

4 結(jié)論

3種地衣體將重金屬吸附于表面，阻止其進(jìn)入地衣體內(nèi)是地衣抗重金屬脅迫的一種有效措施，分布于地衣體周?chē)牡匾滦驼婢ㄟ^(guò)這種方式對(duì)其共生藻（位同時(shí)間內(nèi)一定濃度Cu2+脅迫下處理，3種地于地衣體內(nèi)部）提供保護(hù)，使共生藻避免了重金屬銅的毒害作用；在抵御逆境脅迫過(guò)程中，菌藻共生的特殊生物——地卷類(lèi)似高等植物可誘導(dǎo)合成GSH緩解Cu2+脅迫對(duì)地衣體的毒害作用，且地衣抵抗重金屬銅的能力存在一定的差異。