毛沛琪 李厚華 李嬡 曹志秀 韓美玲 張延龍

（西北農(nóng)林科技大學風景園林藝術(shù)學院，楊凌 712100）

牡丹是中國的傳統(tǒng)名貴木本花卉，其不但具有很好的觀賞價值與藥用作用，同時還有較高的油用價值，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，亞麻酸、亞油酸和油酸，具有抗腫瘤、抗炎、改善心血管和調(diào)節(jié)免疫等醫(yī)療保健等功能［1-2］‘鳳丹’牡丹（Paeonia ostii ‘Feng Dan’）為牡丹野生種楊山牡丹的栽培品種，是中國油用牡丹主栽品種，占到目前油用牡丹栽培面積的90%以上。組織培養(yǎng)作為一種新型的育種方式能夠加快繁殖速度并保持親本的優(yōu)良性狀，更加有利于新品種的選育工作，并能在一定程度上克服傳統(tǒng)繁殖方法存在的弊端［3］。在‘鳳丹’牡丹組織培養(yǎng)方面已經(jīng)有許多學者進行了嘗試并且取得了一定的成果，外植體涉及離體胚［4］、鱗芽［5-7］等，但是在實驗過程中均發(fā)現(xiàn)組培材料褐變是‘鳳丹’牡丹快速繁殖的一大障礙，導致其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)受限。該方面的研究相對匱乏，使得防褐劑在褐變過程中的作用機理還不夠明確。

褐變現(xiàn)象是指在建立外植體時，切口附近的細胞受到傷害，分泌酚類化合物，在溢出過程中與外界氧氣發(fā)生氧化反應被迅速氧化變成褐色，外植體也隨之發(fā)生褐變進而死亡的現(xiàn)象［8-9］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，硝酸銀作為防褐劑能夠有效抑制‘鳳丹’牡丹組培過程中的褐變現(xiàn)象，并確定了以‘鳳丹’牡丹芽為材料最適的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，成活率為 64.32%［6］。另一方面，現(xiàn)有研究普遍認為酶促褐變是組織培養(yǎng)過程中引起褐變的主要原因，酚類物質(zhì)作為該反應的底物，其存在直接影響著褐變發(fā)生的水平［10］，已有研究表明，在培養(yǎng)基中添加硝酸銀能夠影響葡萄［11］和胡椒［12］愈傷組織中酚類物質(zhì)的含量，進一步說明硝酸銀作為防褐劑與檸檬酸的抗氧化能力以及活性炭的吸附方法不同，是通過影響酚類物質(zhì)，進而從褐變的源頭控制組培材料的褐變進程的。而類黃酮類化合物作為高等植物中一類次生代謝產(chǎn)物也是酚類物質(zhì)中種類最豐富的分支，其含量與褐變息息相關(guān)［13］。綜上所述，本次研究中選取了在多酚類物質(zhì)合成途徑中有著重要的生物學功能的轉(zhuǎn)錄因子和部分關(guān)鍵的酶類進行實時定量檢測，通過分析硝酸銀對愈傷組織中酚類物質(zhì)含量極類黃酮合成路徑相關(guān)基因的影響，探究硝酸銀對牡丹組培苗愈傷組織褐變進程的影響，為‘鳳丹’牡丹褐變深層次原因分析以及新型防褐劑的開發(fā)和使用方法提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 選取同一時期培育的‘鳳丹’牡丹生長健壯、無褐化、生長量相同的組培苗。

標準樣品：蘆丁、綠原酸、香豆酸、根皮苷購自天津易方科技有限公司；兒茶素、表兒茶素、槲皮素，購自金測分析技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器和試劑 Applied Biosystems StepOne Plus實時定量PCR儀（Applied，美國）；紫外可見分光光度計（島津UV-2450）；高效液相色譜儀（日立L-2000，檢測器為L-2490DAD）。

北京百泰克生物技術(shù)公司的通用植物總RNA提取試劑盒及其配套的除DNA酶試劑、TaKaRa公司生產(chǎn)的cDNA第一鏈合成試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time） 以及TaKaRa TaqTMVersion 2.0聚合酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase聚合酶、以及實時熒光定量試劑SYBR? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）。

1.1.3 實驗處理 選取生長健壯，無污染無褐化現(xiàn)象出現(xiàn)的組培苗接種至含有1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L硝酸銀的培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）中，以不加硝酸銀的培養(yǎng)基為對照（CK），共6個組合，組合內(nèi)設(shè)置3組重復，每組20個外植體，在常規(guī)條件下（溫度25±1℃，光強36 μmol·m-2·s-1，光照時間 12 h/d）進行誘導培養(yǎng)。在將材料轉(zhuǎn)接至含有硝酸銀的培養(yǎng)基后7 d左右切口處將逐漸長出愈傷組織，在轉(zhuǎn)接后10 d、30 d、50 d取材統(tǒng)計測量相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2 方法

在轉(zhuǎn)接后10 d、30 d、50 d進行取材，實驗過程中的褐變程度、總酚及單體酚含量測定階段，對每個時期的對照組和5個處理組都進行統(tǒng)計。熒光實時定量階段，只選取對照組和處理組中生長情況最佳的1組進行對比分析。

1.2.1 褐變分級 褐變級別根據(jù)愈傷組織褐色顏色深淺劃分為五個等級，用1、2、3、4、5分別表示（圖1）。對每組中的20個外植體進行打分，取加權(quán)平均值作為每組的最終褐化等級。

1.2.2 酚類物質(zhì)測定 粗提取液制備：取經(jīng)處理的愈傷組織進行冷凍干燥；精確稱取粉末0.03 g，用1.5 mL甲醇浸提，超聲提取60 min，浸提結(jié)束后，4 000 r/min離心10 min，收集上清液備用。

多酚含量測定參考Yi等［14］方法并略作修改。將沒食子酸用滅菌去離子水溶解成濃度為104 μg/mL的標準液，分別將標準液0、0.10、0.30、0.50、0.80與1.00 mL置于10 mL離心管中，然后依次加入1.70 mL 20%的Na2CO3·10H2O溶液以及500 μL稀釋一倍的Folin-Ciocalteu試劑，蒸餾水定容。避光放置90 min后，測定吸光值（最大吸光值765 nm處），標曲為 y=0.1196x（R2=0.9970），x的單位是 μg/mL。吸取100 μL提取液，按標準曲線步驟反應后測吸光度，結(jié)果以每百克干樣所含沒食子酸的當量毫克數(shù)（mg /100 g DW）表示。

單體酚種類和含量測定：將上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液為待測提取液，進樣量為0.5 mL；利用高效液相色譜儀測定單體酚種類及含量，設(shè)定參數(shù)為Lachrom-C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm，進樣量10 μL，柱溫箱的溫度40℃。流動相有兩個，A：0.04%的甲酸水，B：乙腈（色譜級）。梯度洗脫（流速為0.5 mL/min）：0到40 min，A 為95%-0，B為5%-100%；40-60 min，B為100%。

圖1 ‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐變程度的五個等級

表1 實時定量PCR引物

1.2.3 實時熒光定量PCR

（1）RNA的提取和cDNA第一鏈合成：參照北京百泰克生物技術(shù)公司生產(chǎn)的通用植物總RNA提取試劑盒說明書提取‘鳳丹’牡丹愈傷組織總RNA，對總RNA進行濃度、完整性等質(zhì)量檢驗后將其濃度調(diào)整至1 μg/μL，-80℃保存?zhèn)溆?。采用TaKaRa公司生產(chǎn)的試劑盒合成cDNA第一鏈。

（2）類黃酮合成途徑關(guān)鍵基因定量分析：根據(jù)Zhang等［15］和 Zhao等［16］對牡丹類黃酮合成途徑的研究，選取了在酚類物質(zhì)合成過程中具有關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)基因，使用軟件Primer 5.0設(shè)計PCR引物（表1）。熒光定量在Applied Biosystems StepOne Plus實時定量PCR儀中進行，以牡丹β-微管蛋白基因beta-Tubulin（登錄號：EF608942）為內(nèi)參，反應體系含 2.0 μL 濃度為 50 ng/μL 的 cDNA、0.8 μL上下游引物（引物溶解濃度為10 μmol），6.0 μL的ddH2O 和 10 μL SYBR Premix Ex Taq II。

反應程序為95℃預變性10 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸31 s，循環(huán)45次，每組處理3個重復。反應結(jié)束后采用2-ΔΔCT法［17］分析熒光值變化曲線和溶解曲線。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 在探究硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐化控制作用試驗中，每組試驗設(shè)不同處理，根據(jù)培養(yǎng)基中加入的硝酸銀濃度的不同設(shè)不同處理組，共6個組合，每個組合中設(shè)置3組重復，每組20個外植體，獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件，進行方差分析及差異性顯著檢驗。

2 結(jié)果

2.1 硝酸銀濃度對組培苗褐變程度的影響

不同濃度的硝酸銀處理下，通過對褐變程度的分級可以發(fā)現(xiàn)（表2），添加硝酸銀能夠明顯抑制牡丹組培苗的褐變，隨著硝酸銀濃度的增加，褐化抑制效果先有所提高，但超過3 mg/L后抑制效果開始明顯下降，綜合各方面表現(xiàn)，當硝酸銀濃度為2 mg/L的處理組對褐化的抑制綜合效果最好。并且隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度硝酸銀處理組之間的褐變差異也逐漸明顯。

表2 不同硝酸銀濃度培養(yǎng)下‘鳳丹’牡丹愈傷組織的褐化級別

2.2 總酚含量的變化

紫外分光光度計檢測結(jié)果（圖2）表明，在‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐化過程中，其總酚含量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高。3個培養(yǎng)階段對照組的總酚含量均高于處理組。培養(yǎng)10 d時不同處理的實驗材料初步表現(xiàn)出一定的差異，隨著培養(yǎng)時間延長差異逐漸增大，50 d時呈現(xiàn)出顯著差異。各個取材階段中隨著AgNO3濃度的增加，總酚含量先減少后升高。其中，AgNO3濃度為2 mg/L時愈傷組織中的總酚含量在3個測試階段均表現(xiàn)為各組最低。

圖2 硝酸銀濃度對‘鳳丹’牡丹愈傷組織總酚含量的影響

2.3 單體酚含量變化

分析‘鳳丹’牡丹愈傷組織甲醇萃取液在280 nm波長下的高效液相色譜檢測結(jié)果（圖3），可以鑒定出6種單體酚，分別是蘆丁、綠原酸、對香豆酸、香豆酸、二氫槲皮素、表兒茶素。這些單體酚的含量隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸升高，其中蘆丁含量最高且相較其他幾種單體酚增幅也最大，說明蘆丁在‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐化過程中被氧化的最少。

與總酚含量測量結(jié)果一致的是，同一取材時間點對照組的6種單體酚含量均多于處理組，其中Ag-NO3濃度為2 mg/L時單體酚含量均表現(xiàn)為各組最低。

2.4 愈傷組織中類黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因表達分析

熒光實時定量的分析結(jié)果（圖4）表明，‘鳳丹’牡丹愈傷組織中結(jié)構(gòu)基因苯丙氨酸解氨酶（PAL）、黃烷酮醇還原酶（DFR）、查耳酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、3-二氫黃酮羥化酶（F3H）、黃酮醇 3′-羥化酶（F3′H），轉(zhuǎn)錄因子 MYB2、WD40-1、WD40-2的表達量都隨著培養(yǎng)時間的增加而增多，且在硝酸銀處理的愈傷組織中的表達量明顯低于對照組；轉(zhuǎn)錄因子bHLH1、bHLH3的表達量在3個取材時期沒有清晰的變化趨勢；花青素合成酶（ANS）的表達量在不同取材時期較為穩(wěn)定。

2.5 總酚含量、褐變等級與基因表達量的相關(guān)性

用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件分析了本次試驗測定的總酚含量、褐變等級與基因表達量的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明，總多酚與褐變等級呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性（P＜0.01）， 轉(zhuǎn) 錄 因 子 MYB2、WD40-1、WD40-2與結(jié)構(gòu)基因PAL、DFR、CHS、CHI、F3H、F3'H的表達量與褐變等級和總酚含量之間存在顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。ANS、bHLH1、bHLH3的表達量與褐變等級和總酚含量之間不存在相關(guān)性。

圖3 硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織單體酚含量的影響

3 討論

‘鳳丹’牡丹是我國重要的油用牡丹栽培品種，牡丹籽油豐富的營養(yǎng)使其擁有很大的發(fā)展前景和市場需求，但是組織培養(yǎng)過程中的褐變問題嚴重影響了其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的進程。植物組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的褐變主要是由酶促褐變引起的，而酚類物質(zhì)作為酶促褐變反應中的底物，其含量與外植體褐變進程緊密相關(guān)［18-19］。硝酸銀作為防褐劑在枇杷［20］、烏頭［21］、葡萄［10］等材料的組織培養(yǎng)中已有應用。在設(shè)計的5個不同的硝酸銀濃度處理中，當濃度為2.0 mg/L時對褐變的抑制效果最好，濃度持續(xù)升高反而會降低抑制效果，原因可能是，Ag+作為重金屬濃度不斷增加會破壞植物體內(nèi)的酶蛋白結(jié)構(gòu)，細胞的代謝活動因此受阻［22］。本實驗結(jié)果表明，總多酚在褐變發(fā)生過程中與褐變程度呈正相關(guān)。這與許傳俊等［23］在蝴蝶蘭中研究結(jié)果一致。因此推測多酚含量應該是對‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐變影響最大的因素。已有學者通過實驗證明，減少酚類合成可以有效減輕褐變［24-25］，本實驗數(shù)據(jù)也反映出在培養(yǎng)基中加入硝酸銀能夠有效降低酚類物質(zhì)合成，進而達到控制褐變的效果，驗證了硝酸銀能夠影響酚類物質(zhì)的合成［11-12］。實驗中檢測到的綠原酸、二氫槲皮素、香豆酸、對香豆酸、表兒茶素、蘆丁的含量變化與材料的褐變水平相符合，同時這6種單體酚也曾在牡丹葉片中被檢測出［26］。

在本次熒光實時定量選取的3個轉(zhuǎn)錄因子和6個結(jié)構(gòu)基因的表達量都與實驗材料的褐變程度呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。PAL（苯丙氨酸解氨酶）是類苯丙烷代謝途徑的第一個酶，它調(diào)解植物初級代謝的碳流向類苯丙烷代謝途［27-28］，是類黃酮合成的關(guān)鍵酶之一。Singh等［29］曾報道，PAL基因的表達與兒茶素類化合物的積累成正相關(guān)，本實驗進一步驗證了這一結(jié)論。CHS（查爾酮合成酶）是催化類黃酮生物合成的第一步反應，其催化合成的柚皮素查爾酮，經(jīng)黃烷酮醇還原酶（DFR）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、3-二氫黃酮羥化酶（F3H）、黃酮醇 3′-羥化酶（F3′H）催化生成各種不同的多酚類化合物［25-26］。本實驗中，‘鳳丹’牡丹愈傷組織中隨著褐變程度的加深CHS、CHI、DFR、F3H、F3′H這5個酶編碼基因表達較對照組均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，這與周天山等［30］在紫芽茶樹中的實驗結(jié)果一致，但是不同在于ANS在紫芽茶樹中的兩種葉色對比實驗中也存在相關(guān)性變化，在本實驗中不同褐變程度的愈傷組織中卻沒有體現(xiàn)出明顯差異。這可能是因為選取的實驗材料不同，與基因在不同的組織中存在特異性表達有關(guān)。另一方面，根據(jù)已有報道bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)類黃酮生物合成的作用［31］，但是本次實驗結(jié)果中所定量的2個bHLH轉(zhuǎn)錄因子卻沒有表現(xiàn)出與褐變等級的相關(guān)性，分析原因可能是因為目前在已知范圍內(nèi)受bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的植物活性成分主要為花青素，據(jù)此可以推測花青素可能不屬于引起牡丹愈傷組織的褐變的酚類化合物。

圖4 ‘鳳丹’愈傷組織中類黃酮生物合成途徑相關(guān)基因的相對表達量

4 結(jié)論

在‘鳳丹’牡丹初代培養(yǎng)基中添加不同濃度的硝酸銀后，其組培苗愈傷組織的褐變均有不同程度降低，證實了硝酸銀作為防褐劑能夠在有效抑制褐變。當加入的硝酸銀濃度為2.0 mg/L時組培材料的褐變程度為所有試驗組中最低，且組培苗綜合生長效果最好。硝酸銀對組培苗褐變過程中產(chǎn)生影響的單體酚有綠原酸、蘆丁、香豆酸、對香豆酸、表兒茶素、二氫槲皮素。熒光實時定量的檢測結(jié)果表明，硝酸銀通過影響轉(zhuǎn)錄因子MYB2、WD40-1、WD40-2和結(jié)構(gòu)基因PAL、CHS、CHI、DFR、F3H、F3'H進而減少了酚類物質(zhì)的合成，最終實現(xiàn)了減輕‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐變的目的。