戴冬洋 袁麗偉 盛云燕 鄭群

（1. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832003；2. 河北旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院，承德 067000；3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

甜瓜（Cucumis melo L.）是我國重要的經(jīng)濟作物之一，在我國有廣泛的種植面積。甜瓜具有較強的雜種優(yōu)勢，在生產(chǎn)中需要人工去雄，但是容易造成花期損傷及產(chǎn)量下降。而雄性不育的出現(xiàn)，就避免了人工去雄的復(fù)雜工序，節(jié)省人力物力。因此研究甜瓜雄性不育的產(chǎn)生機制，對甜瓜生產(chǎn)具有重要的實踐意義。許多研究者在大白菜［1］、甘藍［2］、水稻［3］、大豆［4］等作物開展了廣泛的雄性不育相關(guān)研究，取得一定的研究進展。Nonomoura等［5］在研究水稻雄性不育時發(fā)現(xiàn)，PAIR系列基因與同源染色體的配對有關(guān)；Nonomoura等［6］還發(fā)現(xiàn)MSP1和花粉母細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，當(dāng)PAIR和MSP1發(fā)生突變會導(dǎo)致雄性不育的發(fā)生?；ǚ勰讣?xì)胞在減數(shù)分裂前形成細(xì)胞壁的主要成分是胼胝質(zhì)［7］；李彥龍等［8］在研究枸杞胼胝質(zhì)酶基因在雄性不育中表達時發(fā)現(xiàn)，LG1的沉默與枸杞的敗育有關(guān)；Jung等［9］研究表明水稻的Udt1缺失會使次級壁細(xì)胞不能正常分化成為成熟的絨氈層細(xì)胞，影響孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂，從而導(dǎo)致雄性不育的發(fā)生；Shi等［10］指出水稻雄性不育突變體dpw的分離和特征，包括花藥發(fā)育缺陷和伴有外壁異常的花粉粒退化，擬南芥中CER6/POP1與花粉外壁的發(fā)育及含油層結(jié)構(gòu)有關(guān)［11］；花藥開裂是釋放花藥的重要過程，樊新萍等［12］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，MYB26/MALE STERILE35（MS35）雄性不育基因調(diào)控藥室內(nèi)壁次生加厚的發(fā)育，影響花藥開裂。近年來，研究雄性不育的手段從形態(tài)學(xué)的觀察到物質(zhì)含量的積累，再到現(xiàn)在較為熱門的基因分子方面，研究者從不同的角度深入研究雄性不育，這使得轉(zhuǎn)錄組測序變成了研究的主流。通過轉(zhuǎn)錄組測序，篩選和預(yù)測導(dǎo)致雄性不育的相關(guān)基因，很多學(xué)者從轉(zhuǎn)錄組測序研究植物雄性不育的分子機制，為研究植物雄性不育提供依據(jù)。王嬌［13］通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和代謝相關(guān)數(shù)據(jù)分析，推測出苯丙素、黃酮類物質(zhì)合成受阻、代謝加快可能是導(dǎo)致104-7A棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育形成的原因；Liu等［14］通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，研究蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體的氧化磷酸化有關(guān)；Guo等［15］通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，研究卷心菜細(xì)胞核雄性不育則主要涉及ATP合成酶。早在1928年就有學(xué)者利用甜瓜進行性別分化的研究，但是近二十年未見相關(guān)報道。隨著科技的發(fā)展，研究手段的不斷更新，對甜瓜雄性不育的研究日趨深入。盛云燕等［16］通過甜瓜雄性不育系MS遺傳規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，雄性不育系MS為1對隱性基因控制的細(xì)胞核雄性不育。然而，目前對甜瓜雄性不育的研究大多停留在生理指標(biāo)和田間表型性狀的研究上，甜瓜雄性不育的分子機制，一直鮮有報道，與其他大田作物相比，甜瓜雄性不育相對滯后。本研究通過選擇雄性不育系MS花蕾不同直徑發(fā)育（2和5 mm）時期雄蕊作為試驗材料，分析在不同雄蕊發(fā)育時期的差異表達基因，為探究甜瓜雄性不育發(fā)生機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用的雄性不育MS為厚皮甜瓜，其雄性不育類型為1對隱性基因控制的細(xì)胞核雄性不育［18］。根據(jù)王強等［17］認(rèn)為甜瓜花期雄蕊分化的關(guān)鍵時期為雄蕊直徑為2—5 mm，選擇甜瓜雄性不育系MS 2和5 mm直徑大小雄蕊，分別取10株，并分別混合放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 選擇甜瓜雄性不育系MS的2和5 mm花蕾直徑大小雄蕊，采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0和Aglient 2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，以保證使用合格的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序 采用Hiseq 4000進行高通量測序，測序讀長為PE 150 bp，測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。對雄性不育系不同時期雄蕊進行測序，每個樣本3次重復(fù)。將下機數(shù)據(jù)進行過濾得到Clean Data，與指定的參考基因組進行序列 比 對：https://melonomics.net/files/Genome/Melon_genome_v3.5.1/，得到Mapped Data，通過blast數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg將獲得的序列進行比對；分析比對所得基因注釋、基因功能，所用數(shù)據(jù)庫為蛋白數(shù)據(jù)庫Nr（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/、http://www.uniprot.org/）、Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）、KEGG 序列比對數(shù)據(jù)庫（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes database）和 COG（http://www.geneontology.org）（e-value約 0.00 001）。

根據(jù)基因在不育系MS的2和5 mm直徑大小雄蕊中表達量進行差異表達分析，以log值＞3或者log值＜-3為標(biāo)準(zhǔn)獲得差異表達基因，并對差異表達基因功能注釋和功能富集等表達水平分析。

1.2.3 差異表達基因的qRT-PCR驗證 采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的RNAprep Pure RNA提取試劑盒，提取混合樣本RNA。RNA濃度大于100 ng/μL，A260/A280比值大于1.8，使用TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。以12個差異表達基因序列為模板，Primer5軟件設(shè)計引物，引物序列由上海生工生物公司合成qRT-PCR在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心完成?；蛎Q及qRT-PCR信息如表1所示。

表1 差異表達基因qRT-PCR驗證引物信息

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果分析

利用HiSeq4000測序技術(shù)對甜瓜雄性不育系2 mm和5 mm大小的雄蕊進行轉(zhuǎn)錄組測序，1/8的測序反應(yīng)，雄性不育兩用系2 mm大小雄蕊平均獲得24 235 823 Clean reads，比對到參考基因組為35 888 838，占Clean reads 74%，比對到參考基因組唯一位置的Reads數(shù)目位35 713 443占所有reads的73.64%，雄性不育系2 mm大小的雄蕊測序數(shù)據(jù)觀察平均含量為44.14%。雄性不育系5 mm大小的雄蕊平均獲得28 694 291 Clean reads，比對到參考基因組為42 608 932，占Clean reads 73.89%，比對到參考基因組唯一位置的Reads數(shù)目位42 381 811占所有reads的73.49%，雄性不育系5 mm大小的雄蕊測序數(shù)據(jù)觀察平均含量為44.09%（表2）。

2.2 GO功能分析

分析比較甜瓜雄性不育系2和5 mm雄蕊的差異表達基因，并進行GO功能分析。比較分析發(fā)現(xiàn)，以Log＞3或者Log＜-3為標(biāo)準(zhǔn)，共有224個基因差異表達，116個基因下調(diào)，108個基因上調(diào)；GO功能分類發(fā)現(xiàn)，80條Unigenes歸入到生物學(xué)過程，75條Unigenes歸入到細(xì)胞學(xué)過程，69條Unigenes歸入到分子功能（圖1）。

2.3 差異表達基因分析

將皮爾遜相關(guān)系數(shù)r作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評估指標(biāo)［19］。r2數(shù)值越大，說明2個重復(fù)樣品相關(guān)性越強。不育系MS 2 mm樣本（T1、T2和T3）與不育系MS 5 mm樣本（T4、T5和T6）重復(fù)性（圖2）。全部樣本3次重復(fù)之間r2值均大于0.8，由此可見在雄性不育系MS 2 mm大小的雄蕊樣本與雄性不育系MS 5 mm大小的雄蕊樣本，相關(guān)性較高，其間的基因表達變異程度較低。

雄性不育系MS 2 mm大小的雄蕊（T1、T2和T3）與雄性不育系MS 5 mm大小的雄蕊（T4、T5和T6）樣本對篩選出的差異表達基因按照具有相同或相似表達模式的進行聚類分析，共分為69類，其中第2類和第3類的差異表達基因極為顯著，在第2類中有5個差異表達基因，第3類中有15個差異表達基因。在這些差異表達基因主要參與多種酶活性、脂質(zhì)代謝過程、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等過程相關(guān)性顯著（P＞0.001），說明雄性不育的發(fā)生過程中與多種酶活性，脂質(zhì)代謝過程，細(xì)胞信號傳導(dǎo)等過程正調(diào)控2個過程存在相關(guān)性（圖3），在多種酶活性，脂質(zhì)代謝過程，細(xì)胞信號傳導(dǎo)等過程雄性不育MS 5 mm大小雄蕊樣本均低于雄性不育MS 2 mm大小雄蕊樣本的表達量。（圖3-b1、圖3-c1），從圖中亦可看出各樣本3次重復(fù)間差異不顯著。

表2 甜瓜雄性不育兩用系測序數(shù)據(jù)

圖1 甜瓜雄性不育系不同階段雄蕊的差異表達基因GO功能分析

圖2 測序樣本3次重復(fù)之間相關(guān)性熱圖

2.4 甜瓜雄性不育差異表達基因的合成途徑

差異表達基因主要參與了玉米素生物合成途徑（ko00908）、戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化途徑（ko00040）、淀粉和蔗糖代謝途徑（ko00500）和半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑（ko00270）。差異表達基因MELO3C012098參與玉米素生物合成途徑，該基因在雄性不育MS 5 mm中表達下調(diào)；差異基因MELO3C015289參與戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化途徑和淀粉和蔗糖代謝途徑，該基因在雄性不育MS 5 mm中表達上調(diào)；差異基因MELO3C019735參與了半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑（圖4），該基因在雄性不育MS 5 mm中表達上調(diào)。

差異表達基因MELO3C012098參與玉米素生物合成途徑，該基因在異戊烯基-ATP轉(zhuǎn)化反式玉米素三磷酸山梨糖醇酯、異戊烯基-ADP轉(zhuǎn)化反式玉米素山梨糖苷二磷酸酯、異戊烯基-AMP轉(zhuǎn)化反式玉米素山梨糖醇單磷酸酯過程中表達為下調(diào)基因，對玉米素的合成有抑制作用。差異基因MELO3C019735在半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成乙烯中的調(diào)節(jié)基因，該基因在合成乙烯過程中為上調(diào)基因，促進了乙烯的生物合成。

2.5 qRT-PCR驗證

根據(jù)差異表達聚類圖中差異顯著性進行篩選，其中12個差異極顯著的基因進行qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示，與多種酶活性相關(guān)的基因有9個，其中MELO3C000409、MELO3C021686、MELO3C026842、MELO3C015289、MELO3C008100、MELO3C006719這6個基因均顯示雄性不育株MS 2 mm大小雄蕊的表達量小于雄性不育系MS 5 mm大小雄蕊的表達量。表達量相差最小的基因是MELO3C026842，MS 5 mm大小雄蕊的表達量是MS 2 mm大小雄蕊的表達量的2倍；編號MELO3C006719基因的表達量，MS 5 mm大小雄蕊的表達量高于MS 2 mm大小雄蕊的表達量近20倍之多。而細(xì)胞信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因MELO3C007725（基因注釋為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白基因）則表現(xiàn)出相反趨勢，MS 2 mm大小雄蕊的表達量高于MS 5 mm大小雄蕊的表達量約為7倍，由此可推測出在甜瓜雄性不育發(fā)生時，細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因的表達量減少，從而影響細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，可能會是發(fā)生花粉敗育（或雄性不育）因素之一。

圖3 甜瓜雄性不育系不同時期雄蕊的差異表達基因聚類圖

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測序時期的選擇

植物的性別發(fā)育，是由多種因素影響的，這分為內(nèi)部因素和外部因素。而植物性別發(fā)育中的雄性性別的分化關(guān)鍵期處于小孢子發(fā)育階段［17］。本研究根據(jù)王薇薇等［18］將小孢子發(fā)育的四分體時期確定到2 mm時期的研究結(jié)果，結(jié)合本課題組前期的研究，將雄性不育研究的轉(zhuǎn)錄組測序時期確定為2和5 mm，分別為花粉發(fā)育的四分體時期和花粉成熟期。前人通過大量研究，均證明小孢子發(fā)育受阻與其雄性不育存在一定的相關(guān)性［19-22］，因此本研究通過前期對不同發(fā)育時期雄蕊的細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果，選擇雄蕊直徑為2和5 mm階段為本研究的重要時期，確保了轉(zhuǎn)錄組測序研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4 甜瓜雄性不育基因參與植物激素類合成途徑

圖5 差異表達基因的qRT-PCR驗證

3.2 酶與雄性不育

本研究共發(fā)現(xiàn)224個差異表達基因，其中與各種酶類相關(guān)的差異基因為9個，包含長鏈醇O-脂肪?；D(zhuǎn)移酶相關(guān)基因、碳水化合物酯酶相關(guān)基因、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因、羧酸酯酶相關(guān)基因、GDSL酯酶/脂肪酶相關(guān)基因及木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶相關(guān)基因等；其中與細(xì)胞信號傳導(dǎo)相關(guān)的差異基因有1個，為細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因。這些基因除細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因和GDSL酯酶/脂肪酶相關(guān)基因在雄性不育株MS 5 mm中表達下調(diào)，其他酶類相關(guān)基因均在雄性不育株MS 2 mm中表達上調(diào)。這些基因主要參與了能量相關(guān)代謝途徑，同時在物質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運、碳水化合物代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面也具有一定功能，這些生物途徑與植物發(fā)育息息相關(guān)［23］。

3.3 玉米素與雄性不育

本研究差異表達基因參與的另一個重要途徑為玉米素生物合成途徑，玉米素是植物體內(nèi)天然存在的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，而細(xì)胞分裂素類物質(zhì)在高濃度條件下會抑制組織呼吸、離體線粒體的抗氰呼吸及總呼吸［2425］。呼吸作用的減弱，必然引起植物體內(nèi)能量代謝紊亂，從而引發(fā)小孢子發(fā)育異?；蛐坌詳∮陌l(fā)生［22］。在白薇等［26］對甜菜不育系及O型系的激素含量研究表明，在營養(yǎng)生長階段玉米素含量為不育系高于保持系。本研究表明，玉米素生物合成相關(guān)基因，在雄性不育MS 2 mm中表達量低于在雄性不育MS 5 mm中的表達量。這表明在甜瓜花芽分化期雄蕊直徑為2-5mm大小的關(guān)鍵時期［17］中MELO3C012098基因的表達量增高，影響呼吸作用，能量供應(yīng)過少，導(dǎo)致不育［27］。

3.4 碳水化合物與雄性不育

淀粉和蔗糖均是植物性別分化時期必要的營養(yǎng)物質(zhì)，在郭麗娟等［20］研究中認(rèn)為茄子花藥中可溶性糖和淀粉含量隨著花藥不同發(fā)育階段而變化，在減數(shù)分裂階段，不育系植株處于較低水平，而保持系則出現(xiàn)一個淀粉積累的高峰。本研究淀粉和蔗糖代謝途徑中的相關(guān)基因在雄性不育MS 5 mm中的表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，營養(yǎng)物質(zhì)的缺少，導(dǎo)致能量代謝緩慢或是紊亂，均可能導(dǎo)致雄性敗育的發(fā)生。

4 結(jié)論

獲得224個差異表達基因，且差異極顯著表達基因中酶類相關(guān)的差異基因為9個，細(xì)胞信號傳導(dǎo)相關(guān)的差異基因1個。雄性不育的發(fā)生與小孢子發(fā)育過程中能量代謝相關(guān)基因的表達量的上升和細(xì)胞信號傳導(dǎo)相關(guān)表達基因表達量的減少存在相關(guān)性。