羅小寧 翟立娟 李想 史倩倩 張延龍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，楊凌 712100）

miRNA是一類廣泛存在于真核生物和病毒中的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度通常為19-24個(gè)核苷酸，在進(jìn)化上具有高度保守性，主要參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)與調(diào)控。miRNA最早是在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的［1］，而植物miRNA的發(fā)現(xiàn)較晚。2002年，Reinhart等［2］在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定了第一批植物miRNA，該項(xiàng)研究標(biāo)志著植物miRNA系統(tǒng)研究的開始。

目前，miRNA的功能研究已成為植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，特別是在農(nóng)作物和園藝植物中進(jìn)行了大量的研究，而園林植物作為城市綠化和建設(shè)的重要植物類群，包括木本和草本的觀花、觀葉或觀果植物，以及適用于園林、綠地和風(fēng)景名勝區(qū)的防護(hù)植物與經(jīng)濟(jì)植物等，在該方面的研究卻相對(duì)較少。近幾年，隨著一些園林植物的全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得，園林植物 miRNA 的鑒定也陸續(xù)開始（表1）。miRNA作為一種內(nèi)源的負(fù)調(diào)控因子，在園林植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫等方面起著十分重要的作用，深入了解園林植物miRNA的生物學(xué)功能將為園林植物育種及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 植物miRNA的生物合成

一般情況下，植物miRNA在合成過程中，先在細(xì)胞核中由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primiRNA），然后由Dicer酶DCL1（Dicer-liker1）進(jìn)行剪切加工，形成包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體（premiRNA），pre-miRNA 在HYL1（Hyponastic Leaves 1）和SE（Serrate）蛋白的協(xié)助下被DCL1進(jìn)一步加工為成熟的miRNA雙鏈復(fù)合體（miRNA：miRNA*）。miRNA：miRNA*經(jīng) HEN1（Hua-Enhancer 1） 甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)其3′端的尿嘧啶進(jìn)行甲基化后，在Exportion-5的同源蛋白HASTY蛋白的協(xié)助下從細(xì)胞核運(yùn)向細(xì)胞質(zhì)中。miRNA*鏈被降解，另一條單鏈則選擇性結(jié)合到AGO 1（Argonaute 1）蛋白上形成RISC（RNA Induced Silencing Complex）復(fù)合體（圖 1）。

需要提到的是，通常認(rèn)為生物體內(nèi)miRNA*很容易被降解，表達(dá)水平也很低。然而在多種園林植物中都發(fā)現(xiàn)miRNA*的表達(dá)豐度很高，如苜蓿（Medicago sativa L.）［3］、 日 本 落 葉 松（Larix kaempferi（Lamb.）Carr.）［4］、 椰 棗（Phoenix dactylifera L.）［5］等。以椰棗為例［6］，在椰棗中鑒定的 6個(gè)miRNA*（miR160a*、miR164b*、miR169b*、miR395f*、miR396a*和 miR5225*） 的 表 達(dá) 水 平都比它們相應(yīng)的成熟miRNA的表達(dá)水平高，其中miR160a*和miR5225*的多數(shù)靶基因都是轉(zhuǎn)座元件編碼的轉(zhuǎn)錄本，miR395f*的靶基因大多是一些保守的轉(zhuǎn)錄因子，包括GRAS、MYB、HLH和F-box，說明這些miRNA*在園林植物中可能具有非常重要的功能。

表1 miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的園林植物miRNA數(shù)量

2 植物miRNA的作用機(jī)制

miRNA在植物體內(nèi)的作用方式主要有剪切、翻譯抑制和DNA水平的甲基化3種（圖2）。

2.1 miRNA的剪切

在植物中，miRNA對(duì)靶mRNA的剪切作用是主要的調(diào)控方式。若植物miRNA與其靶mRNA的堿基序列幾乎完全互補(bǔ)配對(duì)，則RISC復(fù)合體中的miRNA在AGO1蛋白的作用下切割靶mRNA上的一個(gè)磷酸二酯鍵，導(dǎo)致mRNA降解。植物miRNA與其靶mRNA之間的理想互補(bǔ)錯(cuò)配數(shù)一般不超過3個(gè)，且第10、11位堿基不能有錯(cuò)配。但是最近的研究表明，有些園林植物miRNA的剪切位點(diǎn)會(huì)偏離第10與11位堿基，如中間錦雞兒（Caragana intermedia Kuang）［7］和高山松［8］。

圖1 植物miRNA的生物合成過程（修改自Abolfazl等［3］）

2.2 miRNA的翻譯抑制

當(dāng)miRNA與其靶mRNA的堿基不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，miRNA則通過抑制靶mRNA的翻譯來完成調(diào)控。此時(shí)，miRNA與靶mRNA的3′UTR（Untranslated regions）區(qū)結(jié)合并改變mRNA上核糖體密度或特異性降解新合成的多肽鏈來抑制mRNA的翻譯。但是Voinnet等［9］以擬南芥為材料，通過遺傳學(xué)手段篩選出一系列miRNA活性缺陷（miRNA-action deficient，mad）突變體，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA既能切割靶標(biāo)基因，也能抑制其翻譯，并且切割與抑制協(xié)同進(jìn)行。

2.3 miRNA介導(dǎo)的DNA甲基化

除了以上兩種方式外，植物miRNA還可以介導(dǎo)DNA的甲基化從而調(diào)控基因表達(dá)。Wu等［10］研究發(fā)現(xiàn)，水稻（Oryza sativa）中的miR1873可以介導(dǎo)其產(chǎn)生位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化，甲基化位點(diǎn)集中在miRNA和miRNA*區(qū)域，并且在該研究中介導(dǎo)DNA甲基化的水稻miRNA是由DCL3加工剪切，最后結(jié)合到AGO 4蛋白上從而形成RISC復(fù)合體（圖2）。在 小 立 碗 蘚（Physcomitrella patens） 中，DICERLIKE1a能夠促進(jìn)miRNA成熟，DICER-LIKE1b蛋白控制miRNA的靶位調(diào)控作用。當(dāng)DICER-LIKE1b蛋白發(fā)生突變時(shí)，編碼miRNA靶位點(diǎn)的基因則被甲基化并導(dǎo)致基因沉默［11］。實(shí)際上植物miRNA介導(dǎo)的DNA甲基化研究目前還處于起步階段，許多具體的調(diào)控機(jī)制還不明晰，相信在不久的將來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和完善，這一調(diào)控機(jī)制的研究終將揭開其神秘的面紗。

由表4和表5可知，熱風(fēng)溫度和風(fēng)速對(duì)辣椒干燥速率的影響程度都很顯著，熱風(fēng)溫度較風(fēng)速更顯著。熱風(fēng)溫度對(duì)辣椒干燥速率的影響占主要地位，風(fēng)速占次要地位。這與圖1和圖2得出的初步結(jié)果一致。辣椒熱風(fēng)干燥的最佳干燥工藝為A6B2，即分階段控制溫度熱風(fēng)干燥，初始溫度為45℃，150min后迅速升溫至60℃，風(fēng)速為1.2m/s，辣椒達(dá)到安全含水率的總干燥時(shí)間為420min。

3 園林植物miRNA的生物學(xué)功能

自從2002年Reinhart等［2］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了第一批植物miRNA后，植物miRNA的功能研究在近20年迅速發(fā)展起來，并且成為植物分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究證明miRNA廣泛的參與園林植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程并且在園林植物逆境脅迫中起著關(guān)鍵作用。

3.1 miRNA與園林植物的生長(zhǎng)發(fā)育

隨著園林植物miRNA研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明miRNA參與調(diào)控園林植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)過程。

3.1.1 miRNA與胚胎發(fā)育 已有的研究表明miRNA與園林植物的胚胎和種子發(fā)育有著密切的關(guān)系，Zhang等［12］對(duì)葉籽銀杏（Ginkgo biloba var. epiphylla Mak.）葉生胚珠的發(fā)生機(jī)理進(jìn)行了深入的研究分析，以著生葉生胚珠的葉片（EL）和正常葉片（NL）為樣品，發(fā)現(xiàn)gbi-miRN02在EL中特異性表達(dá)，通過作用于靶基因CLV1參與葉生胚珠的發(fā)生和發(fā)育過程。與此相反，gbi-miR390在NL中上調(diào)表達(dá)，通過負(fù)調(diào)控其靶基因BAM1從而抑制胚珠發(fā)育，維持了葉片的正常形態(tài)；miR166家族成員和miRN40在EL表達(dá)量下調(diào)，而它們的靶基因HD-ZIPⅢ轉(zhuǎn)錄因子和BEL1-like protein上調(diào)，很有可能參與胚珠形成。此外，miR166也是植物體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵miRNA之一，該 miRNA在細(xì)葉百合（Lilium pumilum DC.Fisch.）EC1（初始培養(yǎng)4周的胚性愈傷組織）階段表達(dá)量積累，在EC2（初始培養(yǎng)6周的胚性愈傷組織）階段表達(dá)量降低，隨著體細(xì)胞胚發(fā)育，在CE（子葉形胚）階段又呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)［13］，說明在細(xì)葉百合體細(xì)胞胚發(fā)育的整個(gè)過程中，miR166通過多樣性表達(dá)從而調(diào)控胚性細(xì)胞形成和體細(xì)胞胚的發(fā)生。Zhao等［14］系統(tǒng)分析了種植在南京和拉薩的高油和低油油菜品系胚胎發(fā)育早期miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR390通過ta-siRNA介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑從而調(diào)控早期的胚胎發(fā)育。此外，在胚胎發(fā)育后期，miR156、miR167和miR6029通過調(diào)控靶基因SPL、ARF和VIP1等多種途徑影響油菜種子的含油量。

3.1.2 miRNA與葉片發(fā)育 葉片的形態(tài)發(fā)育決定了園林植物的觀賞價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，已有的研究表明，許多miRNA在園林植物葉片形態(tài)調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。番木瓜cpa-miR-novel-7可能通過調(diào)控靶基因RTFL5導(dǎo)致葉片出現(xiàn)斑點(diǎn)等癥狀［15］；將毛竹［Phyllostachys edulis（Carr.）Lehaie］的 miR164b前體序列轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行過表達(dá)，獲得的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片畸形或合生而呈耳狀葉或馬蹄葉、葉片邊緣有缺刻、葉柄融合，而且miR164b明顯積累，靶基因 CUC1 與CUC2 的表達(dá)量則明顯下降［16］，表明miR164b通過抑制其靶基因的表達(dá)從而參與毛竹葉片的形態(tài)建成。然而，相比于T2代植株葉邊緣變異的表型，T3 代植株的葉緣鋸齒減少，更加光滑，同時(shí)葉片變小，蓮座葉數(shù)量明顯減少，長(zhǎng)勢(shì)較弱［16］，這可能是由葉片形態(tài)建成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)決定的，同時(shí)也可能與擬南芥自身的修復(fù)能力有關(guān)。

圖2 植物miRNA作用機(jī)制（修改自Wu等［10］）

3.1.3 miRNA與分枝發(fā)育 園林植物的分枝決定著自身的發(fā)育狀況和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，如對(duì)光合作用的利用率、營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸、株型和結(jié)實(shí)量等，所以分枝發(fā)育狀況對(duì)園林植物的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有至關(guān)重要的作用。miRNA在一定程度上調(diào)控著園林植物的分枝發(fā)育，但是迄今為止人們對(duì)其具體的作用機(jī)理還知之甚少。Shikata等［17］將擬南芥miR157b轉(zhuǎn)入夏堇（Torenia fournieri Linden. ex Fourn.）中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出高度的分枝表型，同時(shí)葉片明顯變小。同樣，過表達(dá)35S∷BnamiR1140的油菜陽(yáng)性株分枝數(shù)明顯增多，表現(xiàn)雙主序表型，推測(cè)Bna-miR1140可能參與調(diào)控油菜的分枝發(fā)育；繼續(xù)對(duì)pBna-miR1140∷GUS轉(zhuǎn)基因油菜的不同組織和器官進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果GUS只在葉柄和葉腋中表達(dá)，進(jìn)一步證明Bna-miR1140與油菜的分枝發(fā)育有關(guān)［18］。研究表明生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等植物激素在調(diào)控植物分枝發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用［19］，而Bna-miR1140的潛在靶基因?yàn)橐环N糖基轉(zhuǎn)移酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子［20］，它們與植物激素信號(hào)之間的作用關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

3.1.4 miRNA與花發(fā)育 花發(fā)育以其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理在園林植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，近年來，越來越多的研究表明miRNA廣泛的參與園林植物的花發(fā)育過程，如花期調(diào)控、花器官發(fā)育、花的育性等。朵麗蝶蘭（Doritaenopsis hybrid）的Dh miR172能夠?qū)е聰M南芥植株生長(zhǎng)矮小，頂端優(yōu)勢(shì)被抑制以及花期延后［21］。另外，在短日照條件下，大巖桐（Sinningia speciosa（Lodd.）Hiern）的35S∷miR159a過表達(dá)株系延遲開花37（±4.93）d，而對(duì)miR159具有抑制作用的35S∷MIM159轉(zhuǎn)基因株系提前開花20（±3.5）d，所以改變miR159的表達(dá)水平能夠調(diào)控靶基因GAMYB的表達(dá)，從而對(duì)大巖桐的開花時(shí)間具有提前或推遲作用［22］。

miR172/AP2 調(diào)控通路在園林植物花器官的發(fā)育和繁衍過程中起著至關(guān)重要的作用。近年來，獼猴桃（Actinidia Chinensis Planch）因其豐富的花色、多樣的果實(shí)類型和較長(zhǎng)的觀賞期而作為優(yōu)良的園林樹種［23］，缺失 miR172 導(dǎo)致其無限花序發(fā)育異常［24］；墨 蘭（Cymbidium sinense（Jackson ex Andr.）Willd.）中的miR172能夠通過調(diào)控其靶基因 Ce AP2-like 轉(zhuǎn)錄因子來決定墨蘭花的結(jié)構(gòu)［25］。同樣的，在模式植物擬南芥中AP2類基因上的miR172結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，其花器官發(fā)育嚴(yán)重缺陷［26］，而且miR172在內(nèi)輪花中表達(dá)，并下調(diào)AP2基因，因?yàn)長(zhǎng)EUNIG（LUG）和SEUSS（SEU）基因共同抑制miR172在外輪花的表達(dá)，這為闡釋A-C拮抗的調(diào)控機(jī)制和miR172/AP2的調(diào)控通路提供了新的視角。

研究發(fā)現(xiàn)，一些保守的miRNA家族決定著園林植物花的育性。如文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge） 中 的 miR159、miR167、miR169和 miR319在重瓣型中的上調(diào)表達(dá)可能與重瓣花的雌雄蕊發(fā)生瓣化完全不結(jié)實(shí)，育性降低有關(guān)［27］；其中的miR159在蘋果中則通過靶向6個(gè)MYB18亞家族基因從而影響花粉和花藥的發(fā)育［28］。miR160d在蘆筍（Asparagus officinalis）雌花中上調(diào)表達(dá)同時(shí)抑制生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF的表達(dá)；miR396f在蘆筍雄花中上調(diào)表達(dá)同時(shí)抑制生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子GRF的表達(dá)，說明miR160d和miR396f可能分別通過調(diào)控其靶基因來決定蘆筍的性別分化和雌雄花的發(fā)育［29］。

3.1.6 miRNA與發(fā)育時(shí)序的轉(zhuǎn)變 園林植物的一生要經(jīng)歷幼年、成年和生殖生長(zhǎng)3個(gè)重要階段，每個(gè)階段都有其獨(dú)自的特征，每個(gè)時(shí)序的轉(zhuǎn)換也可以通過形態(tài)學(xué)的標(biāo)記加以區(qū)分。園林植物發(fā)育時(shí)序的轉(zhuǎn)變是由內(nèi)源因素和環(huán)境條件共同決定的，而miRNA在其中的調(diào)控作用是必不可少的。

miR156 被認(rèn)為是一個(gè)植物年齡的分子標(biāo)記，miR156-SPL調(diào)控機(jī)制在植物發(fā)育時(shí)序轉(zhuǎn)變，特別是從幼年期到成年期的轉(zhuǎn)變以及成花誘導(dǎo)方面起著主要調(diào)控作用［33］。如在加楊（Populus canadensis）中過表達(dá)miR156導(dǎo)致其靶基因SPL和miR172的表達(dá)降低，大大延長(zhǎng)了幼年期，同時(shí)該研究還表明miR156在調(diào)控一年生草本植物和多年生木本植物的發(fā)育階段轉(zhuǎn)變中都具有進(jìn)化上的保守性［34］。除了miR156，中間錦雞兒cin-miR157a與cin-miR172b之間也存在一種相反的調(diào)控方式，即cin-miR157a在幼年期表達(dá)量最高，在向成年期轉(zhuǎn)變的過程中逐漸降低，cin-miR172b則正好相反，在幼年期有較低的表達(dá)水平，成年期表達(dá)量最高；而它們的靶基因SPL和AP2恰好與其miRNA表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)［35］，表明cin-miR157a和cin-miR172b通過其靶基因來調(diào)控中間錦雞兒發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變。此外，cin-miR396a在成年期營(yíng)養(yǎng)器官中有較高的表達(dá)量，在其他時(shí)期和器官中表達(dá)量極低，而它的目標(biāo)基因GRF（調(diào)控植物細(xì)胞分裂）則相反，說明中間錦雞兒幼年期和生殖器官中細(xì)胞的分裂通過cin-miR396a負(fù)調(diào)控其靶基因GRF來維持，而成年期營(yíng)養(yǎng)器官成熟細(xì)胞的再分裂則被抑制［35］。甜橙中的miR3954a能觸發(fā)其靶基因產(chǎn)生phasiRNA，miR3954a超表達(dá)子代陽(yáng)性植株與野生型相比，縮短了童期，但miR3954a觸發(fā)產(chǎn)生phasiRNA的具體作用機(jī)理還并不清楚，有待進(jìn)一步研究［31］。

3.2 miRNA與園林植物的次級(jí)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

近年來，越來越多的研究表明，miRNA對(duì)園林植物的次級(jí)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一定的調(diào)控作用，其靶基因通常為一些與次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的信號(hào)分子。例如，蘆筍中的miR160d和miR396f很有可能通過激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑控制著蘆筍雌雄花的分化和性別決定［30］。在銀杏胚珠的形成過程中，gbimiR167c/e和gbi-miRN41的靶基因也均參與生長(zhǎng)素合成與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中g(shù)bi-miR167的靶基因?yàn)锳RF6/8［12］，ARF6/8在生殖過程中還能激活其他生長(zhǎng)素響應(yīng)因子［36］。除了gbi-miR167以外，gbi-miR160通過作用于ARF10/16/17在葉籽銀杏生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中同樣發(fā)揮重要的作用；gbi-miRN41和gbi-miRN46的靶基因分別為IAA7和TIR1/AFB auxin receptor protien，在葉籽銀杏EL中表達(dá)量下調(diào)，從而促使生長(zhǎng)素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；保守gbi-miR394的靶基因被預(yù)測(cè)為F-box蛋白，F(xiàn)-box蛋白在調(diào)控生長(zhǎng)素、茉莉酸、赤霉素和乙烯等植物激素信號(hào)方面有重要作用［12］，EL中顯著上調(diào)的gbimiR394可能通過抑制其靶基因F-box的表達(dá)來促進(jìn)乙烯的合成。

3.3 miRNA與園林植物的逆境脅迫

植物在其或長(zhǎng)或短的生命進(jìn)程中會(huì)受到各種各樣的生物和非生物逆境脅迫，經(jīng)過這些脅迫，植物演化出了特有的、復(fù)雜且精細(xì)的分子調(diào)控機(jī)制。園林植物也不例外，不同的逆境脅迫會(huì)使其相應(yīng)miRNA不同程度地上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，有時(shí)miRNA還會(huì)同時(shí)受幾種逆境脅迫的誘導(dǎo)。許多miRNA在園林植物感受逆境脅迫并產(chǎn)生適應(yīng)性的過程中發(fā)揮重要作用。

3.3.1 miRNA與生物逆境脅迫 生物逆境脅迫主要包括真菌、病毒和昆蟲等的侵染和傷害，嚴(yán)重危害園林植物的生長(zhǎng)發(fā)育。馬超等［37］在蘋果抗性品種“雞冠”中注射Md-miRLn11后接種斑點(diǎn)落葉病菌，96.5%的株系都不同程度地感染了斑點(diǎn)落葉?。辉诟胁∑贩N“富士”中注射Md-NBS基因，53.9%的株系對(duì)斑點(diǎn)落葉病具有抗性，29.5%的植株則表現(xiàn)出較嚴(yán)重的感病表型。該結(jié)果表明在蘋果中Md-miRLn11可以通過調(diào)控其靶基因Md-NBS來改變植株對(duì)斑點(diǎn)落葉病的抗性。對(duì)歐美楊（Populus euramericana）進(jìn)行E4強(qiáng)致病銹菌侵染不僅影響R2R3-MYBs的表達(dá)量，導(dǎo)致R2R3-MYBs表達(dá)的啟動(dòng)或關(guān)閉，而且R2R3-MYBs在轉(zhuǎn)錄后水平主要受miR159和miR858家族的調(diào)控［38］。芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）因易感葡萄孢菌而嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值。Zhao等［39］初步鑒定了兩個(gè)具有不同程度抗病性的芍藥品種中差異表達(dá)的miRNA，并且預(yù)測(cè)了它們的靶基因，兩者呈現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，其中 miR5254、miR165a-3p、miR3897-3p和 miR6450a可能參與芍藥對(duì)葡萄孢菌感染的響應(yīng)。除了病菌侵染，miRNA同樣響應(yīng)昆蟲的傷害。例如，在對(duì)菊花（Dendranthema morifolium（Ramat.）Kitamura）蚜蟲抗性相關(guān)miRNA的分析中發(fā)現(xiàn)，在蚜蟲脅迫的菊花葉片中miR393b-5p顯著表達(dá)，而在另外兩個(gè)對(duì)照樣品（非脅迫對(duì)照和針刺機(jī)械傷害）中幾乎不表達(dá)，說明miR393b-5p參與菊花響應(yīng)蚜蟲脅迫過程［40］。

3.3.2 miRNA與非生物逆境脅迫 非生物逆境脅迫主要包括干旱脅迫、鹽脅迫、溫度脅迫、重金屬脅迫和養(yǎng)分脅迫等，這些脅迫能夠不同程度地上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達(dá)，從而影響著園林植物的生命進(jìn)程。

在干旱脅迫方面，Li等［41］利用高通量測(cè)序技術(shù)和miRNA芯片技術(shù)對(duì)胡楊耐旱節(jié)水的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)104個(gè)胡楊miRNA能夠響應(yīng)干旱脅迫并且其表達(dá)量顯著升高，而另外27個(gè)miRNA的表達(dá)量則降低，其中有23個(gè)miRNA在毛果楊和胡楊之間是保守的，在響應(yīng)脅迫時(shí)差異表達(dá)；毛白楊（Populus tomentosa）在經(jīng)過干旱脅迫后也有17個(gè)保守miRNA家族和9個(gè)新miRNA顯著差異表達(dá)［42］，而且miRNA和miRNA*都參與調(diào)控植物脅迫應(yīng)答。phe-miR397和phe-miR1432在干旱處理后的毛竹（Phyllostachys heterocycla（Carr.）Mitford cv.Pubescens）中表達(dá)情況相反，phe-miR397的表達(dá)顯著下調(diào)，phe-miR1432的表達(dá)顯著上調(diào)，說明它們可能在毛竹應(yīng)對(duì)干旱脅迫的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［43］。

在鹽脅迫方面，中間錦雞兒在經(jīng)過鹽脅迫處理后，SPL（cin-miR157a的目標(biāo)基因）、HD-ZIPⅢ（cin-miR165a的目標(biāo)基因）、AP2（cin-miR172b的目標(biāo)基因）和GRF（cin-miR396a的目標(biāo)基因）均先呈下調(diào)表達(dá)，隨后與其相應(yīng)miRNA呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的表達(dá)模式，而MYB在鹽脅迫處理1 h后表達(dá)量先呈下降趨勢(shì)，隨后逐漸升高，與其目標(biāo)基因cin-miR159a呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式［7］，表明MYB在鹽脅迫處理初期受cin-miR159a調(diào)控，而隨后可能受其他機(jī)制調(diào)控。在紅樹（Rhizophoraceae）的伴生植物海馬齒（Sesuvium portulacastrum L.）中對(duì)高鹽響應(yīng)的miRNA在根和葉中表達(dá)量最多，其中miR167在根中表達(dá)量最多，推測(cè)其可能與海馬齒的耐鹽機(jī)制密切相關(guān)［44］。鹽敏感植物青楊（Populus cathayana Rehd.）和耐鹽植物旱柳（Salix matsudana Koidz）分別經(jīng)過鹽脅迫處理，結(jié)果miR398b和miR474c在旱柳中的表達(dá)量上調(diào)，但在青楊中的表達(dá)量降低［45］，表明鹽敏感植物和耐鹽植物在鹽脅迫下miRNA具有不同的表達(dá)模式。

在溫度脅迫方面，Kim等［46］發(fā)現(xiàn)miR156-SPL3分子機(jī)制調(diào)節(jié)FT基因的表達(dá)，當(dāng)植物響應(yīng)外界環(huán)境溫度變化時(shí)，miR156和FT之間的協(xié)同關(guān)系能夠控制開花時(shí)間。與此相似的是，朵麗蝶蘭在低溫成花過程中也存在miR172-FT的調(diào)控途徑，DhmiR172與其靶基因DhAP2、DhTOE1和DhTOE2間存在顯著的負(fù)調(diào)控關(guān)系，但與DhFT的變化趨勢(shì)卻基本一致［21］。萱草［Hemerocallis fulva（L.）L. Hongbaoshi］中與低溫脅迫相關(guān)的miRNA家族有miR391，miR393、miR396和 miR397等［43］；其中 miR393在耐熱型匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）中的作用正好相反，該miRNA在高溫脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)差異顯著［48］；miR396也被證明在向日葵（Helianthus annuus L.）響應(yīng)高溫的早期調(diào)控WRKY6的表達(dá)［49］，該研究將抗miR396的WRKY6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染擬南芥，結(jié)果相比野生型和無miR396抗性的WRKY6轉(zhuǎn)基因植株而言，該植株長(zhǎng)勢(shì)更矮小并且積累更多的花青素，接著對(duì)兩周齡的植株進(jìn)行熱激處理，導(dǎo)致具有miR396抗性的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生致死性損傷，而其他植株則表現(xiàn)良好；同樣的，miR397參與芍藥的熱脅迫響應(yīng)，并且在耐熱型品種中的表達(dá)量更高［50］。因此，上述研究表明這些miRNA在不同類型園林植物的溫度脅迫方面可能具有不同的調(diào)控作用。

在重金屬脅迫方面，Jin等［51］發(fā)現(xiàn)銅脅迫會(huì)不同程度地影響miRNA的表達(dá)，并且該研究小組初步鑒定了楊山牡丹（Paeonia ostii）中參與銅脅迫反應(yīng)的miRNA，結(jié)果表明有12個(gè)保守miRNA和18個(gè)新的miRNA在銅脅迫后表達(dá)量有明顯的變化，這些鑒定的miRNA可能與楊山牡丹銅脅迫反應(yīng)有關(guān)。miR398在銅動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用，銅缺乏會(huì)誘導(dǎo)miR398表達(dá)量上調(diào)，從而導(dǎo)致其靶基因表達(dá)量下調(diào)，同樣的，miR397、miR408 和miR857在銅動(dòng)態(tài)平衡中具有與miR398類似的功能，而且這3個(gè)銅響應(yīng)的miRNA還可以幫助優(yōu)化大多數(shù)含銅蛋白質(zhì)中銅的供應(yīng)［52］。此外，miR393和miR171與重金屬鎘脅迫相關(guān)［53］。

在營(yíng)養(yǎng)脅迫方面，Lu等［54］通過Illumina測(cè)序從甜橙的缺硼根系中分離了52個(gè)上調(diào)表達(dá)和82個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA，表明根系巨大的代謝靈活性可能對(duì)植株的耐缺硼性具有重要作用。缺鐵條件下小金海棠（Malus xiaojinensis）的根和葉中miR394a的表達(dá)先上升后下降，且根部的響應(yīng)較葉片更早，表明缺鐵脅迫后，小金海棠的根部首先響應(yīng)缺鐵反應(yīng)，miR394a先在根部表達(dá)，一段時(shí)間后，缺鐵的長(zhǎng)距離信號(hào)傳至地上部，使地上部也產(chǎn)生缺鐵反應(yīng)，隨之 miR394a 得到表達(dá)［55］。

4 展望

近年來，隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，人們?cè)跀M南芥、水稻、小麥（Triticum aestivum L.）、大豆［Glycine max（L.）Merr.］和玉米（Zea mays）等模式植物，以及果樹、蔬菜等園藝植物中鑒定并驗(yàn)證了大量的miRNA，并且對(duì)其功能研究較深入的多集中在基因組已被解析的植物上，而在園林植物中只進(jìn)行了初步的分析，大部分還停留在發(fā)掘和鑒定階段，所以在今后的研究中要加強(qiáng)對(duì)園林植物的關(guān)注。

miRNA一般通過負(fù)調(diào)控其靶基因在園林植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及逆境脅迫等方面發(fā)揮重要的作用，但隨著對(duì)miRNA功能研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)也未必都是這種情況，如椰棗中pda-novmiR044、pda-nov-miR166、pda-nov-miR168、pda-novmiR178、pda-nov-miR197、pda-nov-miR213和 pdanov-miR228等miRNA的表達(dá)均與其靶基因成正相關(guān)［32］，這可能是由miRNA和其靶基因之間的共表達(dá)所產(chǎn)生的反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致的，類似的情況在擬南芥和水稻中也有報(bào)道［56-57］。對(duì)這些特殊分子機(jī)制的研究將為完善miRNA在園林植物中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要的線索。

花青素和類黃酮作為植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)花色、果色的形成具有重要作用，近年來該方面的研究也備受關(guān)注，而miRNA通過負(fù)調(diào)控其靶基因從而控制著花青素和類黃酮的生物合成，Liu等［58］的研究表明，隨著荔枝（Litchi chinensis Sonn.）中花青素的積累，miR156a的表達(dá)逐漸升高，同時(shí)，miR156a的上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致其靶基因LcSPL1表達(dá)減弱，而LcSPL1通過與LcMYB1互作而負(fù)調(diào)控花青素的生物合成。香蕉（Musa nana Lour.）中的miR5538的靶標(biāo)為二氫黃酮醇4-還原酶DFR（Dihydroflavonol-4-reductase），它是花青素合成途徑的關(guān)鍵酶，miR5538通過作用于DFR來調(diào)控香蕉的花色［59］。但是在園林植物中關(guān)于miRNA調(diào)控花色形成的報(bào)道非常少，目前僅在芍藥中初步鑒定了與黃色形成有關(guān)的miRNA［60］，該研究表明，miR156可能通過負(fù)調(diào)控其靶基因SPL1從而控制芍藥黃色花的形成。因此在今后的研究中需要發(fā)掘更多與園林植物花色形成相關(guān)的miRNA，爭(zhēng)取早日彌補(bǔ)該研究領(lǐng)域的空白，為園林植物的育種及應(yīng)用奠定良好的理論基礎(chǔ)。