潘優(yōu)敏 郭仁勇 陳瑜

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院輸血科（潘優(yōu)敏），檢驗(yàn)科（郭仁勇、陳瑜）

肝硬化患者血液系統(tǒng)中促凝和抗凝因子的失衡引起局部或全身系統(tǒng)的微循環(huán)障礙[1-2]。凝血系統(tǒng)成分的變化影響肝硬化患者肝臟損傷的嚴(yán)重程度，從而導(dǎo)致了并發(fā)癥的發(fā)生，如門靜脈血栓或腹水等[3]。血管性血友病因子（VWF）是內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成的多聚體糖蛋白，可介導(dǎo)血小板黏附于皮下膠原蛋白直接導(dǎo)致靜脈血栓的形成。VWF是血漿VⅢ因子（F VⅢ）的載體，間接保護(hù)FVⅢ不受蛋白水解酶的降解。血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13）主要表達(dá)于肝臟的星狀細(xì)胞，是降解VWF結(jié)構(gòu)的一種金屬蛋白酶[4]。

ABO血型系統(tǒng)已被認(rèn)為是VWF的主要決定性因素之一，VWF蛋白中存在類似于A和B血型抗原的低聚糖[5]。A和B等位基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶可通過H抗原抑制ADAMTS 13酶對(duì)血漿VWF的水解作用。O血型人群缺乏糖基轉(zhuǎn)移酶，其血漿VWF水解率明顯高于非O血型人群，導(dǎo)致其血漿中VWF水平明顯降低。本研究通過檢測(cè)不同血型肝硬化患者中VWF抗原（VWF:Ag）、F VⅢ活性（F VⅢ:Ac）及 ADAMTS13抗原（ADAMTS13:Ag）的水平，探討肝硬化患者血型和病情分級(jí)與3種因子的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2016年5月至2017年4月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院治療的228例肝硬化患者（肝硬化患者組），其中男 152例，女 76例，年齡 30～60（54.9±5.5歲）。肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)全國(guó)性病毒性肝炎的預(yù)防和診療計(jì)劃[6]。入選標(biāo)準(zhǔn)：入院前3個(gè)月內(nèi)未作任何肝臟疾病治療。根據(jù)本研究設(shè)計(jì)要求，排除標(biāo)準(zhǔn)：存在高血壓、肝細(xì)胞癌、糖尿病、凝血障礙、敗血癥、心血管疾病、抗凝或皮質(zhì)類固醇使用、腎移植、艾滋病毒感染和懷孕的肝硬化患者。健康對(duì)照組為同期本院正常體檢人群168 例，其中男 106 例，女 62 例，年齡 30～60（54.0±9.5歲）。兩組對(duì)象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)并得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集與檢測(cè) 入院后第1天清晨采集患者靜脈血樣送檢。使用含檸檬酸三鈉的試管在1 500r/min、4℃條件下離心10min分離出血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（試劑盒由美國(guó)R&D公司提供）檢測(cè)VWF:Ag和ADAMTS13:Ag，使用德國(guó)Siemens公司試劑盒在Sysmex CA7000全自動(dòng)凝血分析儀上（日本Sysmex公司）檢測(cè)F VⅢ:Ac、纖維蛋白原（Fib）及D-二聚體的水平；含有乙二胺四乙酸（2.4mg/2ml靜脈血樣）的試管收集的血樣標(biāo)本采用抗A抗B血型定型試劑（中國(guó)上海血液生物醫(yī)藥有限公司）以間接方法檢測(cè)ABO血型的表現(xiàn)型，使用pocH-80i血液分析儀（日本Sysmex公司）檢測(cè)PLT；無任何抗凝劑試管的血樣標(biāo)本在3 000r/min、4℃條件下離心10min立即分離出血清，使用德國(guó)Roche公司專用試劑在日立7600自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi公司）檢測(cè)ALT、AST和TB水平。健康對(duì)照組人群均在清晨采集靜脈血標(biāo)本后按上述方法收集及檢測(cè)。

1.3 觀察項(xiàng)目 比較兩組研究對(duì)象的性別、年齡和上述檢測(cè)項(xiàng)目所得結(jié)果等臨床參數(shù)；O血型與非O血型亞組進(jìn)行比較；根據(jù)Child-Turcotte-Pugh（CTP）和終末期肝病模型（MELD）的等級(jí)評(píng)分，對(duì)不同疾病程度肝硬化患者O血型與非O血型亞組間VWF:Ag、F VIII:Ac、ADAMTS13:Ag水平進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用表示，兩組樣本臨床參數(shù)計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象的臨床參數(shù)比較 見表1。

表1 兩組研究對(duì)象的臨床基本信息和分布特征比較

由表1可見，與健康對(duì)照組比較，肝硬化患者組血漿VWF:Ag和FVⅢ:Ac水平明顯升高，而ADAMTS13:Ag水平則明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；肝硬化患者BMI指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；O血型和非O血型比例也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.2 兩組O血型與非O血型亞組間臨床參數(shù)的比較 見表2。

由表2可見，與O血型肝硬化患者相比，非O血型患者血漿中 ALT、AST、TB、D-dimmer的水平及 VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平有顯著的升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而Fib及PLT水平則明顯的降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與O血型健康對(duì)照組相比，非O血型健康對(duì)照組的ALT、AST、TB、D-二聚體的水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩組ADAMTS13:Ag水平在O血型與非O血型之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 兩組O血型與非O血型亞組間臨床參數(shù)的比較

2.3 不同疾病程度肝硬化患者O血型與非O血型組間 VWF:Ag、F VⅢ:Ac、ADAMTS13:Ag的比較 根據(jù)CTP和MELD的評(píng)分等級(jí)，肝硬化患者組分別被分為亞組 Child A、Child B 和 Child C 及 Meld 1（≤7）和 Meld 2（＞7）[7]。與 Child A 肝硬化患者相比，Child C 肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與Meld 1肝硬化患者相比，Meld 2肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。此外，在CTP和MELD評(píng)分的亞組分析中，O血型與非O血型肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平也存在相似的結(jié)果（均P＜0.05）。而無論CTP和MELD評(píng)分，ADAMTS13:Ag水平在O血型與非O血型肝硬化患者間無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖 1、2。

3 討論

Hulstein等[8]和Stepanian等[9]報(bào)道在溶血、肝酶升高、血小板減少（HELLP）綜合征或子癇前期的孕婦中不同程度的內(nèi)皮細(xì)胞急性激活后釋放異常龐大的VWF多聚體，在血漿中被ADAMTS13酶在A2域分解成小的VWF多聚體，從而引起VWF水平的增高和ADAMTS13水平的降低。我們的結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，肝硬化患者肝臟內(nèi)皮細(xì)胞的損傷引起VWF:Ag與F VⅢ:Ac水平的升高和ADAMTS13:Ag水平的降低（表1）。在血漿ADAMTS13缺乏的情況下，累積的VWF的多聚體表現(xiàn)出更加生物的活性，在高剪切應(yīng)力的條件下誘導(dǎo)血小板聚集微血栓形成，從而促進(jìn)了靜脈微循環(huán)的障礙[10]。而肝硬化患者ADAMTS13:Ag的降低可能是由于其被升高VWF:Ag水平的降解及肝臟星狀細(xì)胞釋放ADAMTS13:Ag水平的減少；患者F VIII:Ac水平的升高可能是由于VWF作為FVIII因子的載體，保護(hù)了F VIII不受蛋白水解酶的降解[11]。

圖1 根據(jù)C T P評(píng)分等級(jí)的分組，肝硬化患者F VⅢ:A c（a）、V W F:Ag（b）及 ADA M T S13:Ag（c）在 O 血型與非 O 血型組間的比較

圖2 根據(jù)M ELD評(píng)分等級(jí)的分組，肝硬化患者F V III:A c（a）、V W F:Ag（b）及ADA M T S13:Ag（c）在O血型與非O血型組間的比較

Danyelle等[12]提出非O血型的血液透析患者血漿VWF:Ag被ADAMTS13酶分解的速率明顯低于O血型患者VWF:Ag的分解速率。因此，非O血型的患者具有相對(duì)較高的VWF:Ag和F VIII:Ac水平，導(dǎo)致血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)增大。本研究顯示非O血型肝硬化患者存在顯著升高的VWF:Ag水平和 F VIII:Ac（表2），甚至在CTP和MELD評(píng)分亞組分析中存在相似的結(jié)果?？赡苁怯捎诜荗血型肝硬化患者肝臟內(nèi)皮細(xì)胞的損傷釋放大量的VWF多聚體；也可能是因?yàn)檠獫{VWF的N-聯(lián)寡糖和a2-巨球蛋白表達(dá)ABO血型抗原，而VWF的A、B抗原結(jié)構(gòu)以共價(jià)鍵與VWF的N-聯(lián)寡糖相結(jié)合，保護(hù)VWF免受ADAMTS13酶的降解，從而引起明顯升高的VWF水平[13]。相反，O血型肝硬化患者因缺乏A、B抗原而表現(xiàn)出相對(duì)低水平的VWF:Ag。因此相對(duì)于O血型肝硬化患者，非O血型的患者存在更高水平的VWF:Ag，從而促進(jìn)了患者靜脈微循環(huán)障礙或高凝狀態(tài)的形成。

然而，ADAMTS13:Ag在O血型與非O血型肝硬化患者間不存在明顯的差異，可能是因?yàn)楦斡不颊吒闻K星狀細(xì)胞釋放少量的ADAMTS13，其水平的變化超過或掩蓋了ABO血型對(duì)ADAMTS13的影響。健康對(duì)照組人群中ADAMTS13:Ag水平在O血型與非O血型間的比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于標(biāo)本數(shù)量的局限性導(dǎo)致VWF和ADAMTS13平衡的代償機(jī)制沒有發(fā)揮重要的意義。

CTP和MELD的評(píng)分已經(jīng)廣泛用于評(píng)估肝硬化患者肝臟疾病的嚴(yán)重程度[7]。隨著肝臟疾病損傷嚴(yán)重程度的增加，VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平均存在遞增的趨勢(shì)（圖1、2），而且O血型或非O血型的患者分別存在相似的遞增趨勢(shì)。在CTP和MELD評(píng)分的亞組中非O血型患者VWF:Ag水平及F VⅢ:Ac明顯高于O血型患者的水平，表明非O血型患者的肝臟損傷比O血型患者更加的嚴(yán)重，易引起微循環(huán)障礙而導(dǎo)致靜脈血栓等并發(fā)癥的發(fā)生。以往文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]血漿中ALT、AST、TB與肝臟疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而D-二聚體和Fib呈負(fù)相關(guān)，且非O血型肝硬化患者存在升高的ALT、AST、TB和D-二聚體及降低的Fib和 PLT（表 2）。從而更進(jìn)一步證實(shí)了非O血型肝硬化患者肝臟損傷程度較O血型患者更加的嚴(yán)重。

綜上所述，非O血型肝硬化患者存在升高的VWF:Ag水平和F VⅢ:Ac，且易形成靜脈微循環(huán)障礙狀態(tài)，其病情的發(fā)展較O血型患者更加的嚴(yán)重，并可誘發(fā)相關(guān)肝硬化并發(fā)癥，如靜脈血栓等。因此，為了降低非O血型肝硬化患者病情進(jìn)一步發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，建議患者定期的門診隨訪而采取一些有效的防治措施。