朱 杰, 劉 海, 吳邦魁, 袁 峰, 劉章勇, 金 濤

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稻蝦共作對(duì)稻田土壤反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響*

朱 杰, 劉 海, 吳邦魁, 袁 峰, 劉章勇, 金 濤**

(長(zhǎng)江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心/湖北省澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 荊州 434025)

稻蝦共作是水稻種植與克氏螯蝦共作形成的互利共生的稻田種養(yǎng)復(fù)合生態(tài)模式。目前對(duì)稻蝦共作模式稻田反硝化微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。本研究以江漢平原常規(guī)中稻模式(MR)為對(duì)照, 設(shè)置連續(xù)3年(2014—2016年)稻蝦共作模式(CR)為處理, 通過(guò)特異引物提取中稻抽穗期稻田土壤基因, 采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù), 探討稻蝦共作模式對(duì)稻田土壤反硝化微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明: 稻蝦共作模式顯著提升水稻抽穗期稻田土壤中硝態(tài)氮、全氮及全碳的含量, 對(duì)土壤碳氮比、堿解氮和銨態(tài)氮含量沒(méi)有顯著影響。稻蝦共作模式顯著增加稻田土壤基因微生物的豐富度指數(shù), 但對(duì)基因微生物的多樣性指數(shù)影響不顯著。稻蝦共作模式改變了基因微生物在目、科、屬、種水平的群落組成, 較常規(guī)中稻模式, 稻蝦共作模式在各分類(lèi)水平組成類(lèi)群均減少; 稻蝦共作模式較常規(guī)中稻模式改變了目的種類(lèi), 對(duì)共有目相對(duì)豐度沒(méi)有顯著性改變。RDA分析表明稻蝦共作模式對(duì)土壤基因菌群的群落結(jié)構(gòu)有一定的改變, 但稻蝦共作模式與常規(guī)中稻模式在群落結(jié)構(gòu)上仍保留著一定的相似性。硝態(tài)氮含量是影響反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主效因子?？梢?jiàn), 稻蝦共作模式對(duì)微生物多樣性指數(shù)沒(méi)有顯著影響, 但顯著增加了微生物豐富度指數(shù), 改變了稻田土壤反硝化微生物在目、科、屬、種的群落結(jié)構(gòu)。

江漢平原; 稻蝦共作; 克氏螯蝦;基因; 反硝化微生物; 群落結(jié)構(gòu); 硝態(tài)氮; 高通量測(cè)序技術(shù)

反硝化作用是在低氧或厭氧條件下, 由反硝化細(xì)菌介導(dǎo)以硝酸鹽或亞硝酸鹽作為末端電子受體還原成氣態(tài)氮化合物(N2、NO和N2O)的生物異化過(guò)程[1], 該過(guò)程是生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的重要組成部分。具有反硝化功能的基因分布非常廣泛, 細(xì)菌種群豐富, 與系統(tǒng)分化無(wú)關(guān), 不能通過(guò)16S rRNA反映環(huán)境中反硝化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育情況及群落結(jié)構(gòu)特征[2], 利用反硝化功能基因研究不同土壤環(huán)境中的反硝化細(xì)菌群落成為目前的必然趨勢(shì)。研究表明, 硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、異化亞硝酸鹽還原酶以及氧化亞氮還原酶是反硝化過(guò)程中4種互相獨(dú)立的關(guān)鍵酶, 其中亞硝酸還原酶調(diào)控的是將亞硝酸鹽還原成NO的反應(yīng), 該反應(yīng)是區(qū)分硝酸鹽呼吸菌和反硝化菌的標(biāo)志性反應(yīng)[3]。亞硝酸還原酶包含亞硝酸還原酶(基因編碼)和細(xì)胞色素亞硝酸還原酶(基因編碼)2種不同的結(jié)構(gòu)形態(tài), 其中基因反硝化細(xì)菌以假單胞菌(spp.)占優(yōu)勢(shì); 而基因存在于許多親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株中[3]。因此, 通過(guò)研究反應(yīng)環(huán)境中的基因反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)更具有真實(shí)性和代表性。

大量研究表明,型反硝化細(xì)菌存在于農(nóng)田、森林、草地、沉積物及水體等環(huán)境中[4-8], 并且發(fā)現(xiàn)環(huán)境性質(zhì)的改變可以影響型微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性, 如NO3-、全氮含量、pH等[9], 同時(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性又能反映環(huán)境因子的綜合作用。在我國(guó)南方稻作區(qū), 水稻()種植與蛙、魚(yú)、蝦、鴨等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖相結(jié)合形成的互利共生稻田種養(yǎng)復(fù)合生態(tài)模式是一種主要的種養(yǎng)模式[10]。水稻種植與克氏螯蝦()共作形成的稻蝦共作模式是稻田綜合種養(yǎng)模式之一, 截至2016年, 僅在江漢平原推廣面積已達(dá)20萬(wàn)hm2以上[11]。曹湊貴等[12]指出全國(guó)范圍內(nèi)適宜稻蝦共作的面積占現(xiàn)有稻田總面積的15%, 具有較大的發(fā)展?jié)摿?。稻蝦共作模式不僅具有極高的經(jīng)濟(jì)效益, 相比傳統(tǒng)中稻模式, 該模式還可以改善土壤結(jié)構(gòu), 增加土壤養(yǎng)分[10]。但目前對(duì)于稻蝦共作模式的生態(tài)研究多集中于宏觀的N2O排放及土壤性質(zhì)的研究。徐祥玉等[11]發(fā)現(xiàn), 稻蝦共作可以顯著降低稻田N2O排放, 而稻田土壤N2O排放主要來(lái)自土壤微生物過(guò)程, 需要對(duì)稻蝦共作土壤N2O排放的微生物調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此, 通過(guò)研究基因型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性, 對(duì)于深入認(rèn)識(shí)稻蝦共作模式稻田反硝化作用的微生物調(diào)控機(jī)制具有十分重要的意義。

本文利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)稻蝦共作模式稻田土壤中反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析, 并通過(guò)冗余分析(RDA)來(lái)探索影響反硝化細(xì)菌的關(guān)鍵因子, 以期揭示稻蝦共作模式土壤反硝化細(xì)菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化, 為深入認(rèn)識(shí)該種植模式下反硝化作用微生物調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)試驗(yàn)基地(30°6′N(xiāo), 111°54′E), 屬江漢平原漬澇農(nóng)田區(qū)域。該地區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候, 為沖積性母質(zhì)發(fā)育的水稻土, 年平均氣溫約16.4 ℃, 全年≥0 ℃積溫6 228.4 ℃,無(wú)霜期250 d, 年均降雨量1 148 mm, 年均日照時(shí)數(shù)2 000 h, 年太陽(yáng)輻射總值約470 J×cm-2。

試驗(yàn)設(shè)置稻蝦共作模式(CR)和常規(guī)中稻模式(MR)兩個(gè)處理, 各處理分別設(shè)置3個(gè)小區(qū), 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 小區(qū)面積為60 m2。水稻品種為‘豐兩優(yōu)香一號(hào)’。兩種模式稻田均采用秸稈還田, 施肥管理采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)措施。氮、磷、鉀肥施用量分別為N 240 kg×hm-2、P2O5120 kg×hm-2、K2O 120 kg×hm-2。氮肥按基肥∶分蘗肥∶拔節(jié)肥∶穗肥=4∶3∶2∶1施用, 磷肥一次性基施, 鉀肥作基肥和長(zhǎng)粗肥每次施用50%。兩種模式水稻生長(zhǎng)期間均采用前期灌水、中期曬田、后期干濕交替的水分管理模式。其他田間管理?xiàng)l件也相同。

稻蝦共作模式稻田從2014年由常規(guī)中稻稻田改成。水稻移栽3 d后放養(yǎng)蝦苗, 供試品種為‘克氏原鰲蝦’, 投放密度為15.01~22.50萬(wàn)只×hm-2, 均勻分散投入蝦溝, 冬季覆水, 蝦溝上寬0.7 m, 下寬0.5 m, 深0.6 m, 蝦溝圍繞稻田四周, 呈閉合“口”字狀。蝦溝四周外圍設(shè)尼龍攔蝦網(wǎng), 尼龍網(wǎng)沿蝦溝外側(cè)壁埋入地下約1 m, 地上高出稻田約0.3 m, 并用小竹樁支撐。稻田在曬田控蘗及落干時(shí)期, 蝦隨水遷移至蝦溝中, 待復(fù)水后再次進(jìn)入稻田生活。水稻生長(zhǎng)期間不對(duì)克氏螯蝦進(jìn)行任何捕獲, 在水稻收獲前一天統(tǒng)一捕蝦。常規(guī)中稻和稻蝦共作模式均于每年5月中下旬進(jìn)行整地、水稻移栽, 采用人工移栽, 寬行窄株, 株行距為16.7 cm×26.6 cm, 9月底收割, 稻草還田。

1.2 土壤樣品采集

于2016年水稻抽穗期(8月6日, 田間水層高度2~5 cm)取稻田表層(0~10 cm)土壤, 采用五點(diǎn)取樣法, 采樣點(diǎn)距離周?chē)仓?~10 cm, 各小區(qū)采集5份土樣均勻混合成1個(gè)樣品, 除去根系、碎石及其他雜物后分為兩部分。一部分迅速用滅菌錫箔紙包裹, 放入液氮罐中低溫保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室后放入超低溫冰箱,-80 ℃保存, 用于微生物研究; 另一部分鮮土采用自封袋密封后帶回實(shí)驗(yàn)室放入冰箱,-4 ℃保存, 測(cè)定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮, 該部分剩余土風(fēng)干后過(guò)100目篩測(cè)定土壤pH、堿解氮、全碳和全氮含量。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤pH采用電位法(水∶土=2.5∶1)測(cè)定; 土壤全碳、全氮均使用元素分析儀(ECS4024, Costech, Italy)測(cè)定[13]; 土壤銨態(tài)氮用1 mol×L-1KCl溶液浸提新鮮土樣后, 在200 r×min-1下振蕩浸提1 h, 靜置, 過(guò)濾, 采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定[14]; 硝態(tài)氮采用203 nm和230 nm雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定[15]; 土壤堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定。

1.4 DNA提取及PCR擴(kuò)增

取0.25 g新鮮土壤樣品, 采用PowerSoil?DNA Isolation Kit(Mobio,USA)試劑盒[16]提取土壤DNA。完成基因組DNA抽提后, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。

選用引物nirK1aCu(5￠-ATCATGGTSCTGCCG-CG-3￠)和nirKR3Cu(5￠-GCCTCGATCAGRTTGTGG-TT-3￠)擴(kuò)增基因[17]。PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase(TransGen AP221-02, 北京, 中國(guó))在PCR儀ABI GeneAmp? 9 700(ABI, CA, USA)上進(jìn)行。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù), 將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN, CA, USA)切膠回收PCR產(chǎn)物, Tris_HCl洗脫; 2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包括: 2×sybr MIX (with ROX)10 μL, 兩種上、下游引物(10 μmol×L-1)各0.2 μL, 樣本1 μL(稀釋8倍), 用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。程序設(shè)置: 95 ℃預(yù)變性600 s; 94 ℃ 20 s, 58.6 ℃ 20 s, 72 ℃ 40 s, 共40個(gè)循環(huán); 72 ℃10 min。

將PCR產(chǎn)物回收, 連接至pUC-T載體(CWBIO, 北京, 中國(guó))上, 轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a后進(jìn)行培養(yǎng), 選擇陽(yáng)性克隆菌株提取質(zhì)粒, 采用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)濃度和純度, 將濃度換算成拷貝數(shù), 梯度稀釋,-80 ℃保存, 用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 熒光定量、Illumina Miseq測(cè)序及序列篩選

參照電泳初步定量結(jié)果, 將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量, 之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求, 進(jìn)行相應(yīng)比例的混合, 然后用Illmumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序, 測(cè)序服務(wù)委托北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

MiSeq測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù), 使用FLASH和Trimmomatic軟件首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系, 將成對(duì)的reads拼接(merge)成1條序列, 同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾, 根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列, 并校正序列方向, 即為優(yōu)化數(shù)據(jù), 數(shù)據(jù)去雜方法和具體參數(shù)設(shè)置依據(jù)楊亞?wèn)|等[18]研究。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Usearch 7.1軟件將優(yōu)質(zhì)序列聚類(lèi)成操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units, OTU), 按照97%相似性對(duì)重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類(lèi), 采用RDP classifier分類(lèi)法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析; 使用Mothur 1.30.1軟件在相似水平97%上進(jìn)行微生物多樣性指數(shù)評(píng)估。數(shù)據(jù)方差分析和相關(guān)性分析用SPSS 20.0軟件完成, 采用單因素方差分析法區(qū)分樣品間的顯著性差異(=3, Tukey,<0.05); 利用R語(yǔ)言工具制作曲線圖及Pearson熱圖, 利用CANOCO 5.0軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)和基因反硝化群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻蝦共作對(duì)土壤相關(guān)理化性質(zhì)的影響

在0~10 cm土層土壤中, 稻蝦共作模式(CR)土壤硝態(tài)氮、全碳、全氮含量均顯著高于常規(guī)中稻模式(MR)(<0.05)(表1)。pH CR低于MR, 差異不顯著(7.41~7.47,>0.05); 堿解氮和銨態(tài)氮含量CR均高于MR, 差異不顯著(>0.05); 碳氮比CR低于MR, 差異不顯著。研究結(jié)果表明, 稻蝦共作模式可顯著提高水稻抽穗期稻田土壤中硝態(tài)氮、全氮及全碳的含量, 對(duì)碳氮比和堿解氮、銨態(tài)氮含量沒(méi)有顯著影響。

表1 稻蝦共作模式對(duì)稻田土壤理化性質(zhì)的影響

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。Values followed by different letters within the same column are significantly different (<0.05).

2.2 兩種模式稻田土壤nirK基因高通量測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)

采用Miseq sequencing技術(shù)對(duì)微生物基因測(cè)序分析, 數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化篩選后6個(gè)樣品共測(cè)得原始序列209 777條, 序列平均長(zhǎng)度為448.16 bp, 共測(cè)得堿基94 009 020個(gè), 所有樣品的序列長(zhǎng)度在202~537 bp(表2)。按97%的相似度對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU分析, 共得到344個(gè)OTUs。對(duì)各樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法, 以抽到的序列數(shù)與它們對(duì)應(yīng)的物種多樣性指數(shù), 構(gòu)建稀釋曲線(rarefaction curves)。樣本Coverage指數(shù)在0.996 6~0.997 8, 稀釋性曲線均趨于平坦飽和, 表明此測(cè)序深度獲得序列數(shù)據(jù)量可以反映土壤樣品基因微生物信息(圖1)。

表2 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式3次重復(fù)土壤樣品測(cè)序結(jié)果

MR1、MR2和MR3分別表示常規(guī)中稻模式的3次重復(fù), CR1、CR2和CR3分別表示稻蝦共作模式的3次重復(fù)。MR1, MR2 and MR3 mean three replicates of the conventional middle rice; CR1, CR2 and CR3 mean three replicates of the rice-crayfish culture.

對(duì)Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(表3), 結(jié)果顯示兩處理間Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異不顯著, CR處理的Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均顯著高于MR處理。Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)是衡量微生物群落豐富度指數(shù), Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是衡量微生物群落多樣性的重要指標(biāo)。結(jié)果表明, 稻蝦共作模式(CR)較常規(guī)中稻模式(MR)顯著增加了稻田土壤基因微生物的群落豐富度, 未顯著改變基因微生物群落的多樣性。

圖1 稻蝦共作模式(CR)和常規(guī)中稻模式(MR)土壤樣品OTU水平Coverage指數(shù)稀釋性曲線

2.3 稻蝦共作對(duì)土壤中nirK基因物種組成的影響

在水稻抽穗期, 對(duì)CR處理和MR處理基因微生物進(jìn)行目、科、屬、種的物種分類(lèi)學(xué)水平分析(圖2)。在目水平上, CR處理和MR處理具有相同的10個(gè)目(圖2a), MR處理獨(dú)有紅螺菌目(Rhodospirillales)。在科水平上, CR處理和MR處理具有相同的15個(gè)科(圖2b), MR處理獨(dú)有紅螺菌科(Rhodospirillaceae)。在屬水平上, CR處理和MR處理具有相同的23個(gè)屬(圖2c), MR處理獨(dú)有2個(gè)屬, 分別是紅螺菌目紅螺菌科的固氮螺菌屬()和根瘤菌目根瘤菌科的中華根瘤菌屬(), CR處理獨(dú)有鹽桿菌目鹽桿菌科的鹽惰菌屬()。在種水平上, CR處理和MR處理具有相同的35個(gè)種(圖2d), MR獨(dú)有8個(gè)種, 分別是紅假單胞菌屬的sp._2-8、, 中華根瘤菌屬的sp._R-24605, 根瘤菌屬的sp._R-24658, 包西氏菌屬的sp._MF18, 中慢生根瘤菌屬的sp._D237c,p__ environmental_samples屬的unculturedmarine, 固氮螺菌屬的sp._ TSH20; CR獨(dú)有2個(gè)種, 分別是p__environmental_samples屬的uncultured和鹽惰菌屬的。分析表明, 稻蝦共作模式改變了常規(guī)稻田模式的基因微生物在目、科、屬、種水平的群落組成, 較常規(guī)中稻模式, 稻蝦共作模式在各分類(lèi)水平組成類(lèi)群均減少。

表3 稻蝦共作模式(CR)和常規(guī)中稻模式(MR)Alpha多樣性指數(shù)

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。Values followed by different letters within the same column are significantly different (<0.05).

圖2 稻蝦共作模式(CR)和常規(guī)中稻模式(MR)土壤樣品nirK基因微生物物種分類(lèi)學(xué)組成Venn圖

a、b、c、d分別表示目、科、屬、種4種分類(lèi)學(xué)水平。a, b, c and d respectively show the taxonomic levels of order, family, genus and species.

2.4 稻蝦共作模式對(duì)nirK基因物種目水平相對(duì)豐度的影響

兩處理所有土壤樣品獲得的基因微生物物種分類(lèi)在3個(gè)界、5個(gè)門(mén)、7個(gè)綱、11個(gè)目、16個(gè)科、26個(gè)屬和45個(gè)種。將無(wú)法分類(lèi)的序列定義為無(wú)法歸類(lèi)。兩處理所有樣品獲得的基因OTUs在分類(lèi)學(xué)界、門(mén)、綱、目、科、屬、種水平上可歸類(lèi)比例為97.8%、96.0%、93.0%、89.0%、84.4%、73.3%和60.0%。

在目水平上, Rhizobiales(根瘤菌目)、unclassified_k__norank_d__Bacteria、unclassified_d__Unclassified、unclassified_p__Proteobacteria和norank_p__environmental_samples_k__norank為兩處理平均相對(duì)豐度同時(shí)大于1%的5個(gè)優(yōu)勢(shì)目(圖3), CR處理3次重復(fù)平均相對(duì)豐度分別為47.0%、40.5%、6.9%、2.0%和3.0%, MR處理3次重復(fù)平均相對(duì)豐度分別為59.4%、31.7%、3.3%、3.2%和2.0%, 兩處理中的優(yōu)勢(shì)目平均相對(duì)豐度差異沒(méi)有達(dá)到顯著水平(>0.05)。Burkholderiales (伯克氏菌目)、Rhodospirillales(紅螺菌目)、unclassified_c__Betaproteobacteria為MR處理平均相對(duì)豐度介于0.01%~1%的目, 平均相對(duì)豐度分別為0.18%、0.07%、0.06%, 在CR處理中平均相對(duì)豐度分別為0.19%、0、0.35%, 其中Burkholderiales和unclassified_c__Betaproteobacteria在兩處理中相對(duì)豐度沒(méi)有達(dá)到顯著性差異, CR處理缺失Rhodospirillales (紅螺菌目)。兩處理共有目的相對(duì)豐度差異不顯著, 稻蝦共作模式較常規(guī)中稻模式改變了目的種類(lèi), 對(duì)共有目相對(duì)豐度沒(méi)有顯著性改變。

圖3 稻蝦共作模式(CR)和常規(guī)中稻模式(MR)樣品nirK基因目水平組成

Halobacteriales: 鹽細(xì)菌; Burkholderiales: 伯克霍爾德氏菌; unclassified_c_Betaproteobacteria:未分類(lèi)c-β蛋白酶細(xì)菌; unclassified_p_proteobacteria: 未分類(lèi)p-蛋白細(xì)菌; Rhizobiales: 根瘤菌; unclassified_c__Alphaproteobacteria: 未分類(lèi)_c__α-蛋白細(xì)菌; Nitrosomonadales: 亞硝化單胞菌目; Rhodospirillales: 紅螺菌目。

2.5 nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行DCA分析, 如果Lengths of gradient第1軸的值大于4.0, 選CCA分析; 如果介于3.0~4.0, 選RDA和CCA分析均可; 如果小于3.0, RDA分析優(yōu)于CCA分析。分析結(jié)果中Lengths of gradient第1軸的大小為0.906, 選用RDA分析環(huán)境因子、樣本、菌群三者間的關(guān)系。

RDA分析的前兩個(gè)排序軸共解釋了91.65%的群落變化(圖4), 第1排序軸(RDA1)解釋了81.04%, 第2排序軸(RDA2)解釋了10.61%。第1排序軸與土壤總碳(TC)、銨態(tài)氮(NH4+-N)、硝態(tài)氮(NO3--N)關(guān)系最為密切; 第2排序軸與堿解氮(AN)關(guān)系最為密切?？傮w而言, 土壤硝態(tài)氮(=0.019)對(duì)細(xì)菌群落的影響最顯著。沿第1軸看, CR1、CR2、CR3和MR1樣本距離較近, 趨于聚集在一起, 表明這4個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu)相近; 相比之下, MR2與MR3樣本距離較近, 表明樣本群落結(jié)構(gòu)相近, MR2和MR3與MR1距離較遠(yuǎn), 說(shuō)明空間異質(zhì)性對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)存在影響。同時(shí), MR2、MR3樣本與CR1、CR2和CR3距離較遠(yuǎn), 表明這兩組樣本群落結(jié)構(gòu)存在差異, 綜合表明稻蝦共作模式對(duì)土壤基因微生物的群落結(jié)構(gòu)有一定的改變, 但稻蝦模式與常規(guī)中稻模式在群落結(jié)構(gòu)上仍保留著一定的相似性, 硝態(tài)氮含量是影響反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主效因子。

圖4 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式土壤化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌群落(屬水平)的冗余分析

MR1、MR2和MR3分別表示常規(guī)中稻模式的3次重復(fù), CR1、CR2和CR3分別表示稻蝦共作模式的3次重復(fù)。TC: 土壤總碳; NO3N: 硝態(tài)氮; NH4N: 銨態(tài)氮; PH: pH; AN: 堿解氮。MR1, MR2 and MR3 mean three replicates of the conventional middle rice; CR1, CR2 and CR3 mean three replicates of the rice-crayfish culture. TC: soil total carbon; NO3N: nitrate nitrogen; NH4N: ammonium nitrogen; PH: pH; AN: available nitrogen.

3 討論

Delmont等[19]研究表明, 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性會(huì)隨著土壤理化性質(zhì)的改變而變化, 土壤理化性質(zhì)在一定程度上決定著土壤微生物結(jié)構(gòu)?？耸向r在稻田取食、蛻皮和排泄等活動(dòng), 可能會(huì)增加土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 導(dǎo)致土壤全氮和全碳含量增加[12]。本研究表明, 稻蝦模式較常規(guī)中稻模式稻田土壤全氮、全碳含量顯著增加, 結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[20]。稻蝦共作模式由于克氏螯蝦營(yíng)底棲生活, 其爬行、潛穴等活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致土壤通透性增加[21], 有研究表明, 穴居活動(dòng)會(huì)顯著影響土壤與環(huán)境之間的水、氣等物質(zhì)交換[22-23], 在通氣良好的情況下部分銨態(tài)氮會(huì)轉(zhuǎn)化成硝態(tài)氮, 可能會(huì)導(dǎo)致稻蝦模式土壤硝態(tài)氮含量增加。本研究中, 相比常規(guī)中稻模式, 稻蝦土壤中全氮、硝態(tài)氮及全氮含量顯著提升,微生物豐富度顯著增加, 結(jié)果與Chen等[24]在研究中得出土壤中全氮、硝態(tài)氮及有機(jī)質(zhì)的改變會(huì)引起土壤中微生物群落的變化結(jié)論相一致?？耸向r等底棲動(dòng)物通過(guò)爬行、覓食和潛穴等生物擾動(dòng)改變了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的供應(yīng), 可能影響著微生物群落結(jié)構(gòu)及豐富度[25]。本研究中功能基因微生物多樣性指數(shù)沒(méi)有顯著改變可能與稻蝦種植年限有關(guān), 3年內(nèi)環(huán)境因子變化可能對(duì)稻蝦表層土壤(0~10 cm)功能基因微生物多樣性的影響還是有限的。

稻蝦共作模式與常規(guī)中稻模式的微生物群落結(jié)構(gòu)組成在目、科、屬、種水平上存在差異。相比MR處理, 稻蝦共作模式缺失紅螺菌目、紅螺菌科、(固氮螺菌屬)及根瘤菌目根瘤菌科的(中華根瘤菌屬), 稻蝦共作模式增加鹽桿菌目鹽桿菌科的(鹽惰菌屬)。稻蝦共作模式缺失的紅螺菌目和根瘤菌目均具有固氮和固碳的功能[25]。梅志平等[26]研究表明紅螺菌具有一定的饑餓存活能力, 同時(shí)紅螺菌在缺失有機(jī)物的生長(zhǎng)環(huán)境下會(huì)利用光能生產(chǎn)有機(jī)物, 在有可利用的有機(jī)物條件下, 便自行生長(zhǎng)[27], 因此稻蝦共作模式缺失紅螺菌不是因?yàn)槿狈t螺菌生存所需有機(jī)物。尤希鳳等[28]研究表明在低于2 000 lx光照條件下, 紅螺菌隨著光照強(qiáng)度的增加生長(zhǎng)速度加快, 同時(shí)紅螺菌是典型的厭氧細(xì)菌, 氧氣的存在制約著紅螺菌的生長(zhǎng)。一方面, 采樣期水稻株高120~130 cm, 生長(zhǎng)旺盛, 田間土壤光照較弱不利于土壤中紅螺菌的生長(zhǎng); 另一方面, 田間水層高度2~5 cm, 稻蝦共作模式中克氏螯蝦的擾動(dòng)可能會(huì)增加土壤中的氧氣, 抑制紅螺菌的生長(zhǎng)。胡千德等[29]研究表明中華根瘤菌屬的模式種費(fèi)氏中華根瘤菌()的耐鹽性較弱, 本研究中稻蝦共作模式的土壤硝酸鹽含量顯著高于常規(guī)中稻模式, 可能是導(dǎo)致稻蝦共作模式缺失中華根瘤菌的原因之一。(鹽惰菌屬)是稻蝦共作模式后增加的菌屬, 目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于稻蝦養(yǎng)殖中增加鹽惰菌屬原因的研究較少, 具體原因有待進(jìn)一步深入研究。克氏螯蝦的生命活動(dòng)可能導(dǎo)致稻田土微域生境條件如含氧量、氧化還原電位等發(fā)生改變[10], 微域生境條件綜合性質(zhì)的改變可能是導(dǎo)致稻蝦模式微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的直接原因。前人研究表明, 紅螺菌能大幅降低水體有機(jī)質(zhì)含量、增加溶氧、改善水質(zhì)[30], 對(duì)Cu2+、Pb2+等重金屬離子有較強(qiáng)的吸附作用[31-32]。本研究表明稻蝦共作模式會(huì)導(dǎo)致土壤中缺失紅螺菌, 因此, 在稻蝦共作實(shí)際生產(chǎn)中增施紅螺菌有助于提升水體凈化能力, 凈化水質(zhì), 有助于蝦的生長(zhǎng), 增加產(chǎn)量。

環(huán)境因子與反硝化細(xì)菌群落的冗余分析(RDA)發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮含量是影響反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主效因子。Xie等[33]通過(guò)研究青藏高原草甸土放牧對(duì)反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響, 發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮是影響反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子, 與本文結(jié)論相一致。硝態(tài)氮作為反硝化反應(yīng)的起始底物之一, 是控制型反硝化細(xì)菌進(jìn)行反硝化作用的重要因素。冗余分析表明, CR處理與MR處理微生物群落結(jié)構(gòu)既有差異性, 又保持一定的相似性, 該結(jié)果與群落物種組成分析和群落目水平相對(duì)豐度分析結(jié)果一致。

4 結(jié)論

與常規(guī)中稻模式相比, 連續(xù)3年稻蝦共作模式可提高稻田土壤全氮、全碳、硝態(tài)氮含量, 對(duì)稻田土壤基因微生物的多樣性指數(shù)無(wú)顯著影響, 但顯著增加了稻田土壤基因微生物群落豐富度指數(shù); 較常規(guī)中稻模式, 稻蝦共作模式?jīng)]有顯著改變基因共有物種目水平的相對(duì)豐度, 但改變了稻田土壤中微生物基因在目、科、屬、種水平的群落組成, 硝態(tài)氮含量是影響反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主效因子。稻蝦共作模式會(huì)導(dǎo)致土壤中缺失紅螺菌, 因此, 在稻蝦共作實(shí)際生產(chǎn)中適當(dāng)增施紅螺菌有助于提高水體凈化能力, 改善蝦生長(zhǎng)水體環(huán)境, 有利于克氏螯蝦的生長(zhǎng), 增加稻蝦經(jīng)濟(jì)收入。

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Effects of integrated rice-crayfish farming system on community structure and diversity ofdenitrification microbe in paddy soils*

ZHU Jie, LIU Hai, WU Bangkui, YUAN Feng, LIU Zhangyong, JIN Tao**

(Yangtze University, Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland, Ministry of Education / Hubei Key Laboratory of Waterlogging Disaster and Wetland Agriculture, Jingzhou 434025, China)

Integrated rice-crayfish farming system is a symbiotic ecological model applicable in paddy field cultivation that is based on the combination of rice planting and clawed crayfish breeding in waterlogged conditions. In spite of so many efforts, the effects of integrated rice-crayfish farming system on denitrifying micro-organism diversity and community structure have remained unclear. In this study, we analyzed soil samples from both consecutive treatment of integrated rice-crayfish farming system (CR) in 2014–2016 and traditional paddy field (MR) treatment in order to investigate the effects of integrated rice-crayfish farming system on microbial diversity and community structure ofdenitrification in paddy soils.. This was done by extracting soilgene from rice field at heading stage using specific primers and Illumina Miseq high-throughput sequencing technology. The results showed that CR significantly increased the contents of nitrate nitrogen, total nitrogen and total carbon in paddy soils at heading stage, but had no significant effect on the ratio of carbon to nitrogen, contents of available nitrogen and ammonium nitrogen in soil. Compared with MR, CR significantly increasedgene abundance in soil, but did not significantly change its diversity. CR treatment changed the composition ofgene micro-organisms in the levels of order, family, genus and species. Compared with MR, CR reduced all taxonomic groups. The analysis of relative abundance of order showed no significant difference between CR and MR treatments. CR treatment changed species order, but did not change the relative abundance of common orders. RDA analysis showed that CR significantly changed community structure ofgene in soil. Nitrate nitrogen content was the main factor affecting the community structure ofdenitrifying bacteria. It was obvious that rice-crayfish farming system had no significant effect on microbial diversity, but significantly increased microbial abundance index. In addition, it changeddenitrifying microbial community structure in terms of order, family, genus and species.

Jianghan Plain; Rice-crayfish farming system; Clawed crayfish;gene; Denitrification microbe; Community structure; Nitrate nitrogen; High-through put sequencing technology

, E-mail: jintao165@126.com

Dec. 14, 2017;

May 4, 2018

10.13930/j.cnki.cjea.171165

S154.3

A

1671-3990(2018)09-1324-09

金濤, 主要研究方向?yàn)橥寥捞嫉h(huán)與生態(tài)環(huán)境。E-mail: jintao165@126.com 朱杰, 主要研究方向?yàn)橥寥牢⑸锓肿由鷳B(tài)。E-mail: hbzj0806@163.com

2017-12-14

2018-05-04

* This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0800102).

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0800102)資助

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ZHU J, LIU H, WU B K, YUAN F, LIU Z Y, JIN T. Effects of integrated rice-crayfish farming system on community structure and diversity ofdenitrification microbe in paddy soils[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(9): 1324-1332