王欣言

（中源協(xié)和生物細胞存儲服務(wù)（天津）有限公司，天津，300384）

CIK細胞是將人外周血單個核細胞（PBMC）在體外用多種細胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)性細胞。該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點，具有增殖能力強、殺瘤活性高、殺瘤普廣等特點，被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。［1］本實驗從正常志愿者外周血分離單個核細胞誘導(dǎo)CIK細胞，研究其在體外的增值規(guī)律、細胞表型變化以及殺瘤活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于以色列BI公司，IL-2、IFN購自廈門特寶生物股份有限公司，淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司CD3mAb細胞因子購自Biolegend公司，CD3-FITC、CD8-PE、CD56-PE、IgG1-PE、IgG1-FITC以 及 流式細胞儀分別購自美國BD公司，K562為本實驗室保存和傳代培養(yǎng)。

1.2 PBMC細胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)

取正常志愿者外周血100mL加入生理鹽水1∶1稀釋后用吸管將血液混合物沿管壁緩慢地加入Ficoll淋巴細胞分離液之上，于500g、19℃，離心23min。用吸管小心吸取第二層白色云霧狀的單個核細胞層于離心管內(nèi)，加入生理鹽水于300g、19℃、離心5min洗滌2次后調(diào)整細胞濃度1.0×106/mL。接種于提前包被好CD3單抗的T175培養(yǎng)瓶，加入血清、IL-2、IFN-γ放置于37℃，5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中。隔天補加培養(yǎng)基、血清、IL-2，觀察細胞狀態(tài)，計數(shù)。

1.3 CIK細胞表型檢測

分別取誘導(dǎo)前的單個核細胞和培養(yǎng)至第13天CIK細胞1×106，離心去上清，用600μL PBS重懸。每次6只流式管，每只流式管內(nèi)加入100μL細胞懸液分別標記帶熒光的單克隆抗體（CD3-FITC）+（IgG1-PE）、（CD8-PE）+（IgG1-FITC）、（CD56-PE）+（IgG1-FITC）、（CD3-FITC）+（CD56-PE）、（CD3-FITC）+（CD8-PE）、（IgG1-FITC）+（IgG1-PE）為陰性對照，室溫避光20min后PBS離心洗滌，每管加入200μLPBS重懸，上機檢測。

1.4 殺瘤活性檢測

取對數(shù)生長期的K562腫瘤細胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度5×104/mL，加于96孔板，每孔加100μL。取培養(yǎng)至13天的CIK細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度，使效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1，每孔加100μL，每組取3復(fù)孔，此為實驗組。另設(shè)空白對照組、效應(yīng)細胞對照組、靶細胞對照組，至于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。取出后加入20μL CCK-8孵育4h后用酶標儀450nm檢測OD值，參比波長620nm，測3次取平均值。殺瘤活性=[1-（實驗組-效應(yīng)對照組）/（靶細胞對照組-空白對照組）]×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 細胞增值情況

懸浮的單個核細胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，細胞明亮，邊緣規(guī)則成圓形。在細胞因子的誘導(dǎo)下，細胞成集落生長，細胞團快速復(fù)制增殖如圖1所示，細胞數(shù)見表1。由表1可見，細胞增殖較快，呈對數(shù)增殖，16天達到增殖高峰。

表1 CIK細胞體外增殖情況

表2 CIK細胞的表型分析（ ±s）

表2 CIK細胞的表型分析（ ±s）

組別 CD3+ CD8+ CD56+ CD3++CD8+ CD3++CD56+PBMC 67.23±3.31 43.61±5.20 22.34±3.30 31.25±0.23 8.85±1.04 CIK 99.00±4.00 73.57±2.42 24.35±3.29 89.28±0.19 21.73±0.90

圖1 成集落生長的CIK細胞

2.2 CIK細胞表型檢測

從表2中可以看出，誘導(dǎo)培養(yǎng)16天后的CIK主要效應(yīng)細胞CD3++CD56+雙陽性細胞比例與未經(jīng)誘導(dǎo)的PBMC細胞大幅上升（P＜0.05）。

2.3 CIK細胞的殺瘤活性

如表3，培養(yǎng)至13天時，CIK細胞對K562細胞的殺傷活性隨著效靶比的增大而逐漸增強（P＜0.05）。

表3 CIK細胞的殺瘤活性

3 討論

惡性腫瘤是一類嚴重危險人類健康的常見病，發(fā)病幾乎可以遍及人體的各個部位、組織、器官。手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療惡性腫瘤的方法很難從根本上完全治愈腫瘤。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展和對腫瘤發(fā)生分子機制的深入研究，生物治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療的第四種模式。雖然現(xiàn)在該治療模式尚不能替代三大傳統(tǒng)手段，仍然處于輔助治療地位，但其在提高手術(shù)、放化療療效以及延長患者生存期、改善生活質(zhì)量方面已經(jīng)受到了越來越多的關(guān)注[2]。

CIK細胞是將人外周血或人臍帶血單個核細胞在體外用多種細胞因子如IFN-γ、IL-2和CD3單抗等誘導(dǎo)而得到的一群異質(zhì)細胞。增殖速度快，在16天左右達到增殖高峰，之后增殖速度明顯下降，細胞數(shù)量開始進入平臺期。CIK細胞是以CD3++CD56+T細胞為主要的效應(yīng)細胞，經(jīng)過細胞因子誘導(dǎo)后培養(yǎng)至16天，流式表型分析發(fā)現(xiàn)，CD3++CD56+雙陽性細胞比例與未經(jīng)誘導(dǎo)的PBMC細胞相比大幅上升。培養(yǎng)至16天的CIK細胞殺瘤活性強，其殺瘤活性隨著效靶比的增加而增強。目前的研究CIK細胞主要通過3種途徑發(fā)揮殺瘤、溶瘤作用：（1）CIK細胞通過釋放顆粒酶／穿孔酶等毒性顆粒，導(dǎo)致腫瘤細胞的裂解；（2）CIK細胞釋放的大量細胞因子（如干擾素γ、腫瘤壞死因子α、IL-2等）不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性直接殺傷腫瘤細胞；（3）CIK細胞能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。CIK細胞表FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)，通過與腫瘤細胞膜表達的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[3]。

CIK細胞的發(fā)現(xiàn)將細胞免疫治療推上了一個新的高點。CIK細胞對腫瘤的強細胞毒性和低毒副作用，為惡性腫瘤的治療提供了新的手段，但在CIK細胞治療的發(fā)展過程中，還有很多問題亟待解決。尋求提高CIK細胞治療效果的有效方法，依然是目前研究的關(guān)注點；此外，CIK細胞的抗腫瘤機制尚未完全明確，治療方法也需要統(tǒng)一的規(guī)范。