賀理，陳潔，陳曦，張睿，陳存

（成都師范學院 化學與生命科學學院，四川成都 611130）

我國是一個農業(yè)大國，在農業(yè)生產過程中，農作物經常會遭受各種病蟲害，其中植物病原細菌引起的植物病害尤為明顯。胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）是多種植物的病原細菌，它主要侵害植物地下部肉質根，造成植物的軟腐與濕腐，如果侵染維管束組織，會阻礙水分輸送而導致地上葉片出現萎蔫等癥狀[1]，對我國農業(yè)生產造成巨大危害，嚴重影響農業(yè)經濟的發(fā)展。近年來，人們對于綠色安全越來越關注，逐漸把目光投向生物抑菌劑，其中植物源抑菌劑由于其提取工藝簡單、效果顯著、無環(huán)境污染而備受人們青睞[2]，因此，對新型植物源性質抑菌抗菌物質的研究也愈加重視。大蒜（Allium sativum）、柑橘（Citrus reticulata）、洋蔥（Allium cepa）、柚子[Citrus maxima (Burm)]等植物具有其特有的抗菌特效，在研發(fā)植物抗菌劑方面具有廣闊的應用前景[3-8]。

本研究采用4種天然植物水提取液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌進行抑菌試驗，篩選具有較高生物活性的植物，為其抑制植物病原細菌以及控制植物病害的發(fā)生等提供理論依據。該方面的研究成果對發(fā)展生態(tài)農業(yè)、促進綠色食品工業(yè)的發(fā)展、構建人與自然環(huán)境的和諧發(fā)展等方面具有十分深遠的意義[9]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora，BNCC138474）菌種凍干粉，購于北京北納創(chuàng)聯生物技術研究院。

1.1.2 供試植物樣品

植物樣品供試部位及產地詳見表1。

表1 供試植物樣品表

1.1.3 主要儀器及試劑

儀器設備：不銹鋼整體式游標卡（DL92150，Deli）；高效液相色譜儀（CBM20A, Shimadzu）。

試驗藥品：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、瓊脂粉、乙腈（色譜純）、去離子水等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備

胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌種凍干粉加入無菌水混勻，接種到營養(yǎng)肉湯平板培養(yǎng)基上，待其生長成熟，挑取單菌落轉接到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值約為0.6時停止培養(yǎng)，放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 天然植物水提液的制備

大蒜鱗莖剝皮、柑橘皮、洋蔥鱗葉剝皮、柚子皮切碎研磨后各稱取20 g，按1∶3比例加入去離子水，室溫下密封浸提4 h，紗布過濾，濾液在離心機10 000 r/min下離心20 min，取上清液通過0.22 μm無菌濾膜，得到4種植物水提液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 天然植物水提液抑菌試驗

將4個滅菌后的牛津杯依次放置在配制好的NB固體培養(yǎng)基上，分別加入100 μL 4種植物水提液（大蒜鱗莖水提液稀釋2倍），置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復3個平板。24 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.4 大蒜鱗莖水提液的液相色譜分析

對大蒜鱗莖水提液中的有效抑菌成分進行高效液相色譜（HPLC）分析，分析條件如下，色譜柱：C18柱（250 mm×4.5 mm），流動相：乙腈/水=30/70（V/V），Diode Array檢測器，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量100 μL，檢測波長210 nm。

2 結果與分析

2.1 四種天然植物水提液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌效果

試驗分別測定了4種植物水提液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌效果，用游標卡尺測量4種植物水提液抑菌圈直徑，結果見表2?？梢钥闯?，4種植物水提液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制效果不同，大蒜鱗莖、柑橘皮、洋蔥鱗葉、柚子皮水提液形成的抑菌圈直徑分別為24.73 mm、5.03 mm、17.8 mm、4.72 mm，說明4種植物水提液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌作用強度依次為大蒜鱗莖水提液＞洋蔥鱗葉水提液＞橘皮＞柚子皮水提液。

2.2 HPLC對大蒜鱗莖水提液有效抑菌成分的分析

利用高效液相色譜對大蒜鱗莖水提液的有效抑菌成分進行分析，得到液相色譜分析結果如圖1和表3?？梢钥闯?，大蒜鱗莖水提液中可能的有效抑菌成分有7種，對胡蘿卜軟腐歐文氏菌明顯的抑菌效果可能是這7種成分中一種或幾種共同作用的結果。

圖1 大蒜鱗莖水提液液相色譜分析圖譜

表2 四種植物水提液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌形成的抑菌圈直徑

表3 大蒜鱗莖水提液液相色譜分析圖譜數據記錄

3 討論

試驗中，大蒜鱗莖水提液在稀釋兩倍后進行抑菌試驗，發(fā)現其抑菌效果依然明顯強于其他3種植物水提液，表明大蒜具有超強殺菌能力。洋蔥鱗葉水提液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌也有一定的抑菌效果，但抑菌效果不如大蒜，而柑橘皮和柚子皮水提液沒有明顯的抑菌效果。一些研究報道中，大多用有機物提取橘皮和柚子皮中的抑菌活性成分。李凌緒等發(fā)現，橘皮石油醚提取物的抑菌效果最好，水提取物的抑菌效果最差，說明橘皮中主要抑菌活性成分可能是低極性物質[10]。此外，唐俊妮等證實，不同洋蔥品種的抑菌效果也會有差異，紫皮洋蔥抑菌效果要稍優(yōu)于白皮洋蔥[11]。因此，同種植物的不同品種的抑菌效果也可能不同。康美玲的研究認為洋蔥原汁的抑菌效果要強于洋蔥提取物的抑菌效果[12]。由此可以思考，是否大蒜原汁、洋蔥原汁、橘皮精油和柚子皮精油的抑菌效果更好，尚需進一步研究。

對大蒜鱗莖水提液進行高效液相色譜分析的結果表明，大蒜鱗莖水提液中含有7種可能的有效抑菌成分，具體的成分需要做氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）才能得到進一步分析，具體是哪一種或哪幾種成分能夠真正抑菌，還需將各成分收集起來進一步進行抑菌試驗，才能分析得出結論。

本試驗中發(fā)現大蒜鱗莖水提液和洋蔥鱗葉水提液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌有抑菌作用，且大蒜鱗莖水提液效果明顯。這為防治胡蘿卜軟腐歐文氏菌對農作物的危害提供了初步理論依據，期望能夠在這一方面繼續(xù)挖掘其價值，推動植物源殺菌劑應用開發(fā)的研究進程，促進生態(tài)農業(yè)和綠色食品工業(yè)的發(fā)展，創(chuàng)造人與自然和諧共存的美好未來。