左銳，林峻，朱琳妍，姜文倩，蔡偉文＊

（1.福州大學(xué) 應(yīng)用基因組學(xué)研究所，福建福州 350108；2.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108）

在人體內(nèi)和人體共生的全部微生物被稱為微生物組（Microbiome），其中腸道微生物最為豐富，數(shù)量約為1014個(gè)，質(zhì)量接近人體的肝臟。微生物對(duì)人類的生理和營(yíng)養(yǎng)具有深遠(yuǎn)意義的影響，是人類生命活動(dòng)中至關(guān)重要的一部分[1]。Bocci提出，腸道微生物是“被忽略的器官”，腸道微生物就像虛擬器官一樣具有一定的代謝功能[2]。諾貝爾獎(jiǎng)得主Joshua Lederberg也曾說(shuō)道，人是由自身細(xì)胞和腸道微生物共同構(gòu)成的超級(jí)生物體（Superorganism），腸道微生物的基因組可被稱為“人類第二基因組”[3]。

腸道微生物具有營(yíng)養(yǎng)吸收、代謝調(diào)控、免疫等重要的生理功能，能夠吸收碳水化合物，幫助消化木聚糖、纖維素等難以消化的營(yíng)養(yǎng)物，吸收鐵、鈣、鎂等離子[4-5]。短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acid，SCFAs）是腸道微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物，可提供能量，也是一種信號(hào)分子。腸道微生物還參與人類心血管疾病相關(guān)的膽堿代謝，參與膽汁酸的合成、代謝和重吸收[6]。宿主和腸道微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化演變中，逐步形成了共生關(guān)系，把人體看成一個(gè)超級(jí)生物體，體內(nèi)的腸道菌群便是自我的一部分而不會(huì)造成免疫排斥。腸道菌群對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟起到重要的作用，能促進(jìn)腸道免疫系統(tǒng)內(nèi)T細(xì)胞的分化，還可通過(guò)直接的競(jìng)爭(zhēng)限制腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物的可利用性，防止外來(lái)病原體的增殖[7]。此外，腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂會(huì)導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)過(guò)于活躍，從而出現(xiàn)自身免疫性疾病[8]。

近年來(lái)，有關(guān)腸道微生物的研究持續(xù)熱門(mén)，多種疾病被發(fā)現(xiàn)與腸道微生態(tài)的紊亂相關(guān)，如腸道細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素在血液中的積累并激發(fā)炎癥反應(yīng)會(huì)造成肥胖和胰島素抵抗[9]；Ⅰ型糖尿病患者腸道菌群中產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌數(shù)量顯著減少，擬桿菌門(mén)比值顯著上升，放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)明顯降低，而Ⅱ型糖尿病患者基本都會(huì)出現(xiàn)中度腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌含量下降，條件致病菌數(shù)量增多，還原硫酸鹽和抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)的顯現(xiàn)[10-11]。此外，結(jié)直腸癌[12-13]、肝癌[14]、乳腺癌[15]等癌癥也已被報(bào)道與腸道菌群的失調(diào)相關(guān)。

分子生物學(xué)手段在腸道微生物的研究中應(yīng)用廣泛，但都以從糞便樣本中更好更完整的提取出宏基因組DNA為基礎(chǔ)，因此確定一個(gè)較好的提取宏基因組DNA的方法對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究和分析至關(guān)重要。本研究選用兩種商業(yè)試劑盒（康為世紀(jì)&康源基因）和一種常見(jiàn)方法CTAB-SDS從KM小鼠糞便樣品中提取腸道微生物宏基因組DNA，并進(jìn)行濃度和純度分析、16S rDNA PCR、限制性酶切、高通量測(cè)序等，以綜合比較三種方法的優(yōu)劣，為提取腸道微生物宏基因組DNA的方法選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品來(lái)源于KM小鼠新鮮糞便，鑷子、1.5 mL離心管等均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌，取樣用籠具經(jīng)紫外線30 min滅菌。樣品取得立即置于冰上，取樣完成后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫保存。

1.1.2 主要試劑

兩種糞便DNA提取試劑盒，分別購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司、中山康源基因技術(shù)科技有限公司；蛋白酶K，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；RNaseA，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；2×Taq Master Mix，購(gòu)自ABM公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ，購(gòu)自Thermo Fisher公司；250bp DNA ladder、λ-Hind Ⅲ digest，購(gòu)自 Takara公司；引物由英濰捷基（上海）有限公司合成；其余試劑或藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

梯度PCR儀GT9612：杭州柏恒科技有限公司；電子分析天平AR224CN：奧豪斯儀器上海有限公司；電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；5430臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；全自動(dòng)凝膠成像儀JS-680D：上海培清科技有限公司；超微量核酸蛋白測(cè)定儀Nanodrop 2000：美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒法

取200 mg左右KM小鼠新鮮糞便，分別按照北京康為世紀(jì)（下文標(biāo)為CW）和中山康源基因（下文標(biāo)為Halgen）的說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.2.2 CTAB-SDS法

參照郭海勇等[16]的方法，有所改動(dòng)。取200 mg左右KM小鼠新鮮糞便，分別加入1 mL DNA提 取 緩 沖 液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA·2Na、1% CTAB、1 mol/L NaCl，pH 8.0）、5 μL蛋白酶 K、300 μL 10% SDS，37 ℃水浴 1 h，間斷混勻3～5次。14 000 r/min離心7 min，取上清，加入等體積酚氯仿（苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1），混勻后14 000 r/min離心7 min，抽提兩次。再取上清加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），14 000 r/min離心7 min抽提一次。取上清加入0.6倍體積異丙醇，-20 ℃冰凍10 min，14 000 r/min離心7 min，獲得的沉淀用80%異丙醇洗兩次，自然晾干后向沉淀中加入200 μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，含 RNaseA，pH8.0），即為宏基因組DNA，凍存于-20 ℃。

1.2.3 宏基因組質(zhì)量檢測(cè)

分別取三種方法所提腸道微生物宏基因組5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA條帶大小和完整性；使用Thermo Nanodrop2000測(cè)定基因組濃度、A260/A280等數(shù)值。

1.2.4 16S rDNA擴(kuò)增

將宏基因組DNA分別稀釋至10 ng、1 ng、0.1 ng作為模板，用細(xì)菌基因組16S通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增所提的小鼠腸道微生物宏基因組DNA，同時(shí)設(shè)置以ddH2O為模板的陰性對(duì)照，以期進(jìn)一步檢測(cè)宏基因組提取質(zhì)量。設(shè)置25 μL反應(yīng)體系：宏基因組DNA 10 ng、1 ng、0.1 ng，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，2×Taq Master mix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)至 25 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72 ℃，3 min。反應(yīng)完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶。

1.2.5 宏基因組DNA限制性酶切

對(duì)三種方法所提腸道微生物宏基因組DNA進(jìn)行Hind Ⅲ限制性酶切，配制20 μL酶切反應(yīng)體系：DNA 500 ng，Hind Ⅲ 1 μL，10×Buffer 2 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL，置于37 ℃反應(yīng)過(guò)夜酶切。酶切完成后，將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶差異。

1.2.6 高通量測(cè)序比較菌群差異

選取同一小鼠糞便經(jīng)三種方法提取的宏基因組DNA，送北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序，比較三種方法所提宏基因組DNA中的菌群豐度等數(shù)值差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠腸道微生物宏基因組DNA的電泳檢測(cè)圖

對(duì)三種方法所提的腸道微生物宏基因組DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示。三種方法均能提取出宏基因組DNA片段，大小約為23 kb。CW Kit所提宏基因組DNA碎片段較少，Halgen Kit和CTABSDS法均有不同程度的拖帶，但主帶較為明亮。

圖1 不同方法所提小鼠糞便宏基因組DNA電泳圖

2.2 宏基因組DNA濃度及純度分析

使用Thermo Scientific Nanodrop2000測(cè)定三種方法提取所得的小鼠腸道微生物宏基因組DNA濃度及純度，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，CTAB-SDS法提取的宏基因組DNA濃度最高，均值達(dá)到346.7 ng/μL，CW kit濃度最低。Halgen Kit所得DNA純度在三種方法中最好，A260/A280均值為1.84。從宏基因組DNA平均得率來(lái)看，CTAB-SDS法最高，Halgen Kit次之，而CW Kit較其他兩種方法相比差距較大。

2.3 16S rDNA的擴(kuò)增

以三種方法所提腸道微生物宏基因組DNA為模板，分別用10 ng、1 ng、0.1 ng DNA模板量，用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示（W代表北京康為，H代表中山康源，S代表CTAB-SDS法）。三種方法的宏基因組DNA模板均能夠擴(kuò)增出16S rDNA片段，大小約為1.5 kb。當(dāng)模板量低至0.1 ng時(shí)，CTAB-SDS法的條帶較暗，可能是提取過(guò)程中的多次抽提導(dǎo)致基因組碎片化，從而降低了PCR效率。所有PCR產(chǎn)物均可用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

表1 三種不同方法提取的小鼠糞便宏基因組DNA濃度及純度

圖2 不同提取方法的定量16S rDNA PCR

2.4 宏基因組DNA酶切效果

分別選取三種方法所提宏基因組DNA進(jìn)行HindⅢ過(guò)夜酶切，效果如圖3所示，CW Kit和CTAB-SDS法所得DNA均有不同程度影響酶切效率的抑制劑殘留，而Halgen Kit所得DNA酶切最為完全，效果較好，可以認(rèn)為基本無(wú)內(nèi)切酶抑制劑殘留。

圖3 Hind Ⅲ酶切效果

2.5 微生物多樣性測(cè)序豐度

所提DNA樣品使用IluminaHiseq平臺(tái)測(cè)序，利用雙末端測(cè)序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)測(cè)序。每種DNA樣品平行測(cè)序兩次，挑選兩次平行測(cè)序偏差較小的差異化細(xì)菌比較豐度數(shù)值，以科（Family）水平為例，數(shù)值差異見(jiàn)表2、3。

對(duì)比上表示例可發(fā)現(xiàn)，不同方法對(duì)腸道微生物宏基因組DNA的提取效果均有不同程度的差別：擬桿菌科細(xì)菌總DNA的提取效率以CTAB-SDS法和CW Kit較高，CTAB-SDS法更好；Halgen Kit對(duì)螺桿菌科細(xì)菌總DNA的提取效率明顯突出；而產(chǎn)堿桿菌科細(xì)菌總DNA的提取效率，則為CW Kit最好。

3 討論

腸道微生物宏基因組DNA的提取質(zhì)量對(duì)后續(xù)研究有著至關(guān)重要的影響，一個(gè)好的方法既要盡可能多地提取出糞便樣品中的總DNA，還要減少基因組的碎片化，高質(zhì)量的宏基因組DNA才能更好地構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，為下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、高通量測(cè)序、基因芯片的雜交等創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。

表2 差異化細(xì)菌豐度均值

表3 差異化細(xì)菌相對(duì)豐度均值

本實(shí)驗(yàn)分別使用了CW和Halgen兩種試劑盒以及CTAB-SDS共三種方法提取小鼠腸道微生物宏基因組DNA，獲得大小均在23 kb左右的宏基因組DNA，并通過(guò)電泳、濃度和純度、16S rDNA擴(kuò)增、宏基因組DNA限制性酶切及高通量測(cè)序檢測(cè)方法，結(jié)合實(shí)際耗時(shí)、操作簡(jiǎn)便程度等綜合比較幾種方法的優(yōu)劣。

CW試劑盒采用的是樣品裂解后釋放出的DNA與吸附柱高效結(jié)合，將糞便中雜質(zhì)蛋白和抑制劑等化合物濾過(guò)的方式。從本次實(shí)驗(yàn)提取效果來(lái)看，所得宏基因組DNA濃度較低，純度較其他兩種方法略有差距，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，曾出現(xiàn)抑制劑殘留導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)條帶的情況，后將所得DNA溶液經(jīng)酚氯仿抽提再重新擴(kuò)增，可見(jiàn)符合大小的16S rDNA條帶。

Halgen試劑盒使用高效液體蛋白酶裂解細(xì)菌以釋放DNA分子，離心去除殘?jiān)笤偌尤胫羷┚奂疍NA分子析出，多次洗滌去除雜質(zhì)、抑制劑等，再通過(guò)含有RNase的溶解液去除RNA。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，所得宏基因組DNA濃度較好，A260/A280均值1.84，純度最好；操作過(guò)程在三種方法中最為簡(jiǎn)便，耗時(shí)最短，從裂解到獲得DNA溶液約1小時(shí)。

CTAB-SDS法為宏基因組DNA提取中比較常見(jiàn)的一種方法，表面活性劑SDS可進(jìn)一步裂解細(xì)胞，再通過(guò)酚氯仿多次抽提，去除蛋白、抑制劑等，獲得宏基因組DNA濃度最高，純度也較好，滿足16S PCR等下游實(shí)驗(yàn)的要求。但耗時(shí)較長(zhǎng)，且需用到苯酚等有毒有機(jī)溶劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員身體有一定的損害。但與商業(yè)試劑盒相比，成本較為低廉。

從16S rDNA擴(kuò)增效果來(lái)看，三種方法都能較好地?cái)U(kuò)增出大小約1.5 kb的條帶，但均有輕微拖帶，可能與糞便樣品本身成分復(fù)雜、提取過(guò)程雜質(zhì)未完全清除等因素有關(guān)。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，不同方法對(duì)于不同類別的細(xì)菌提取效果均存在差異，不同方法均有各自優(yōu)勢(shì)和薄弱方面，比如在螺桿菌科（Helicobacteraceae），Halgen Kit的提取效率明顯好于另外兩種方法，眾所周知的幽門(mén)螺旋桿菌正屬于該科，因而對(duì)有關(guān)這方面的研究來(lái)說(shuō)是較好方法。

綜合以上討論，認(rèn)為三種方法均為提取腸道微生物宏基因組DNA的較好方法，不能簡(jiǎn)單通過(guò)單一因素判定最好方法，具體可由使用者綜合考慮課題研究方向、實(shí)驗(yàn)操作、經(jīng)濟(jì)等多方面因素進(jìn)行選擇。