劉慶帥，孫小娟，謝禛名，郭良川，霍俊偉，秦 棟

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，寒地小漿果開發(fā)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，哈爾濱150030)

植物在正常代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，一定濃度的ROS是植物正常的生理過(guò)程中必不可少的，但一旦過(guò)量就會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，引起植物未成熟衰老和死亡，而在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中積累大量的生物氧自由基，可通過(guò)抗氧化系統(tǒng)清除[1]。抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)，亦稱維生素C，是植物和大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)合成的一類己糖內(nèi)酯化合物，作為植物體內(nèi)重要的抗氧化劑和酶的輔因子，可通過(guò)一系列氧化還原反應(yīng)來(lái)直接清除H2O2。同時(shí)，AsA不僅參與植物細(xì)胞分裂增殖、細(xì)胞壁代謝與細(xì)胞膨大[2]，而且在對(duì)維持植物光合作用、代謝調(diào)控[3]、提高植物抗逆性[4]、參與激素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]和影響開花時(shí)間和衰老[6]等方面發(fā)揮著重要作用。另外，AsA也是人類正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的化合物，但是人類及部分高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物自身由于缺乏關(guān)鍵酶而不能合成AsA，所以人體所需AsA必須從食物中獲得，而蔬菜和水果中含有豐富AsA，是人體攝取AsA的主要來(lái)源。

黑穗醋栗(RibesnigrumL.)屬虎耳草科(Saxifragaceae)茶藨子屬(Ribes)落葉叢生灌木，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，其AsA含量高達(dá)11.36～22.73 μmol/g[7]，僅次于獼猴桃[8]，其AsA含量高于大多數(shù)水果，與越橘、樹莓和沙棘等一起被稱為“第三代”新型水果，是很有發(fā)展前景的天然食物資源。高水平的AsA作為黑穗醋栗的重要品質(zhì)，其AsA合成和代謝的研究對(duì)黑穗醋栗的品質(zhì)發(fā)育具有重要影響。目前對(duì)黑穗醋栗果實(shí)AsA代謝已經(jīng)有了較為深入的系統(tǒng)研究，但對(duì)其葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中AsA合成代謝調(diào)控機(jī)制及品種葉片AsA含量與其果實(shí)中AsA含量關(guān)系尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，黑穗醋栗葉片中AsA含量比果實(shí)還要高，不僅可以直接提取，還可以將葉片烘烤制成獨(dú)特的“黑穗醋栗茶”，另外黑穗醋栗枝葉也是提取珍貴香料的原材料。

現(xiàn)有研究表明葉片衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可分割的一部分，是葉片發(fā)育的最后階段。葉片的衰老除了自身生長(zhǎng)發(fā)育的原因外，還有環(huán)境等其他因素，比如病蟲害、環(huán)境脅迫等也會(huì)引起葉片的衰老[12]。目前對(duì)植物處于脅迫條件下的抗氧化代謝研究較多，而對(duì)自然衰老過(guò)程的植物抗氧化代謝研究很少[13]，近年來(lái)研究表明，AsA還參與植物的衰老調(diào)控[14]。因此研究葉片衰老與植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)系，對(duì)提高作物對(duì)氧化脅迫的抗性有著十分重要的意義。目前對(duì)黑穗醋栗葉片衰老過(guò)程中AsA積累特征的研究還鮮有報(bào)道。

研究植物自身AsA合成代謝規(guī)律，尋找植物不同品種或不同發(fā)育時(shí)期AsA代謝特點(diǎn)，對(duì)進(jìn)一步研究AsA在植物體內(nèi)的功能及其水平調(diào)控具有重要的意義。因此，本試驗(yàn)以3個(gè)不同黑穗醋栗品種的葉片為材料，研究葉片衰老過(guò)程中AsA代謝的規(guī)律，以揭示葉片生長(zhǎng)發(fā)育及自然衰老過(guò)程中AsA含量與代謝合成相關(guān)酶之間的關(guān)系，最終為尋找黑穗醋栗最佳葉片采摘時(shí)期、AsA含量的調(diào)控及延緩葉片衰老進(jìn)程提供理論基礎(chǔ)，也為驗(yàn)證品種葉片AsA含量與其果實(shí)中AsA含量相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為同一生長(zhǎng)地點(diǎn)的3個(gè)不同黑穗醋栗主栽品種‘亞德列娜亞’(以下均簡(jiǎn)稱‘亞德’)、‘布勞德’和‘黑豐’，其中‘亞德’為早熟豐產(chǎn)大果俄羅斯品種，‘布勞德’為中晚熟大果豐產(chǎn)波蘭品種，‘黑豐’為晚熟小果中國(guó)品種，均為10年生成齡小漿果果樹，生長(zhǎng)良好，枝葉量大，常規(guī)管理，在整個(gè)生長(zhǎng)期所有田間管理與當(dāng)?shù)毓麍@一致，定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的黑穗醋栗種質(zhì)資源圃。于2017年4月27日掛牌標(biāo)記生長(zhǎng)健壯的植株上生長(zhǎng)一致的陽(yáng)面外圍春梢頂端新生葉片，即當(dāng)幼葉長(zhǎng)到0.5 cm長(zhǎng)時(shí)開始計(jì)算葉齡。自葉齡為10 d起，每隔7～10 d采取生長(zhǎng)一致的葉片若干為試材，共采樣8次，直至葉片衰老為止，采后的葉片立即投入液氮并帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80 ℃冰箱備用，進(jìn)行后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。采取的黑穗醋栗不同時(shí)期葉片從幼葉期到衰老葉期分別標(biāo)記為幼葉期(S1～S2)、展開葉期(S3～S4)、成熟葉期(S5～S6)、衰老葉期(S7～S8)(圖1)。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

還原型抗壞血酸(AsA)、氧化型抗壞血酸(DHA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的測(cè)定試劑盒及脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶(GalLDH)活性的測(cè)定試劑盒均購(gòu)于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，按照說(shuō)明書進(jìn)行提取、測(cè)定。其中總抗壞血酸(T-AsA)含量為AsA與DHA之和，總谷胱甘肽(T-GSH)含量為GSH與GSSG之和。過(guò)氧化氫(H2O2)含量測(cè)定試劑盒為武漢純度生物科技有限公司產(chǎn)品，按照其說(shuō)明書進(jìn)行提取和測(cè)定。以上每項(xiàng)測(cè)定重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖，以SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

S1～S8代表葉片的不同發(fā)育時(shí)期(S1～S2.幼葉期；S3～S4.展開葉期；S5～S6.成熟葉期；S7～S8.衰老葉期)。下同圖1 黑穗醋栗不同品種葉片衰老過(guò)程中形態(tài)變化S1-S8 represent different developmental stages of the leaves(S1-S2.Young leaf；S3-S4.Full leaf；S5-S6.Mature leaf；S7-S8.Senescent leaf); The same as belowFig.1 Morphological changes in different varieties of black currants during leaf senescence

2 結(jié)果與分析

2.1 各品種黑穗醋栗葉片衰老過(guò)程中AsA、DHA及T-AsA含量的變化特征

在黑穗醋栗葉片生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老過(guò)程中，葉片單位鮮重的抗壞血酸(AsA)含量在生育期之間存在顯著的差異；各品種葉片AsA、氧化型抗壞血酸(DHA)及總抗壞血酸(T-AsA)含量均表現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢(shì)，但DHA變化幅度較小(圖2，Ⅰ～Ⅲ)。首先，‘亞德’、‘布勞德’和‘黑豐’品種葉片的T-AsA含量在幼葉時(shí)期(S1)都比較低，依次為37.54、33.71和32.88 μmol/g；各品種葉片T-AsA含量均在葉片成熟時(shí)期(S6)達(dá)到最高水平，它們依次為115.33、82.24和62.98 μmol/g，此時(shí)葉片已經(jīng)達(dá)到成熟；各品種葉片T-AsA含量在衰老葉期(S8)降到最低，其含量依次為44.32、35.01和30.83 μmol/g，分別僅為葉片成熟期(S6)的38.42%、42.57%和48.95%。其次，3個(gè)品種葉片AsA含量在初葉期含量也較低，之后隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育迅速上升，并在葉片成熟期(S6)達(dá)到峰值，此時(shí)‘亞德’葉片的AsA含量最高，‘布勞德’次之，黑豐較低，其含量依次為98.33、68.17和44.94 μmol/g，分別是幼葉時(shí)期(S1)的6.23、6.02和5.09倍。同時(shí)，葉片成熟期(S6)時(shí)，‘亞德’葉片AsA含量要比‘黑豐’高出2倍多，這進(jìn)一步證實(shí)了黑穗醋栗品種葉片AsA含量具有多樣性。再次，DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物體內(nèi)與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體的作用。對(duì)于黑穗醋栗葉片中DHA含量而言，3個(gè)品種DHA含量在幼葉時(shí)期(S1～S2)均相對(duì)較高，之后隨葉片的衰老不斷下降，至衰老葉時(shí)期(S8)時(shí)降到最低值，總體來(lái)說(shuō)DHA含量在葉片衰老過(guò)程中一直呈降低趨勢(shì)，但變化不明顯(圖2，Ⅲ)。

A.亞德；B.布勞德；C.黑豐；誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差；同一品種內(nèi)不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同圖2 黑穗醋栗不同品種葉片衰老過(guò)程中T-AsA、AsA和DHA含量的變化A. Adelinia; B. Brodtrop; C. Heifeng; Error bars indicate standard deviation; The different normal letter in the same variety showed significant difference at 0.05 level. The same as belowFig.2 Changes of T-AsA, AsA and DHA contents in different varieties of black currants during leaf senescence

2.2 各品種黑穗醋栗葉片衰老過(guò)程中GSH、GSSG及T-GSH含量的變化特征

谷胱甘肽(GSH)是植物體內(nèi)另一個(gè)重要的抗氧化劑和氧化還原勢(shì)的調(diào)節(jié)劑，作為DHA的電子供體，其氧化還原態(tài)是通過(guò)AsA-GSH循環(huán)來(lái)與AsA聯(lián)系的。首先，3個(gè)品種黑穗醋栗葉片總谷胱甘肽(T-GSH)含量相差不大，但在葉片不同生長(zhǎng)階段中，GSH的水平表現(xiàn)出明顯的差異(圖3，Ⅰ～Ⅱ)。3個(gè)品種葉片T-GSH含量從幼葉期(S2)迅速上升，至展開葉時(shí)期(S3～S4)上升到最高值，此時(shí)‘亞德’葉片T-GSH含量最高，為1.10 μmol/g，是‘布勞德’和‘黑豐’的1.09倍和1.41倍，之后隨葉片的衰老而迅速降低。同時(shí)，3個(gè)品種葉片GSH含量與T-GSH含量變化趨勢(shì)一致，均是隨著其葉片生長(zhǎng)進(jìn)程呈現(xiàn)先逐漸增加后降低的趨勢(shì)，均在展開葉初期(S3)或展開葉時(shí)期(S4)中達(dá)到最大，之后隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸降低，至衰老葉時(shí)期(S8)中下降幅度最大；‘亞德’、‘布勞德’和‘黑豐’葉片GSH含量峰值分別為1.07、0.86和0.77 μmol/g，分別是衰老葉時(shí)期(S8)的3.63、4.75和4.85倍。

圖3 黑穗醋栗不同品種葉片衰老過(guò)程中T-GSH、GSH和GSSG含量的變化Fig.3 Changes of T-GSH, GSH and GSSG contents in different varieties of black currants during leaf senescence

另外，在葉片衰老過(guò)程中，3個(gè)品種葉片GSSG含量在幼葉初期(S1)較高，幼葉期(S2)后有所下降，但下降幅度不明顯，之后有所回升；葉片成熟后，GSSG含量隨著葉片的衰老再次顯著降低，并到衰老葉時(shí)期(S8)降至最低值(圖3，Ⅲ)，此時(shí)‘亞德’、‘布勞德’和‘黑豐’葉片GSSG含量分別僅為幼葉時(shí)期(S1)的39.53%、22.05%和31.11%。

2.3 各品種黑穗醋栗葉片衰老過(guò)程中AsA-GSH氧化還原程度的變化特征

AsA/DHA的大小代表了AsA氧化還原程度的高低，比值越高，則還原態(tài)的AsA含量越高，對(duì)AsA的積累越有利。3個(gè)黑穗醋栗品種葉片中AsA/DHA比值變化趨勢(shì)相似，均隨著葉片衰老過(guò)程呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖4，Ⅰ)。其中‘亞德’葉片中AsA/DHA比值高于其他兩個(gè)品種，說(shuō)明‘亞德’葉片中AsA氧化程度較高。在幼葉生長(zhǎng)階段(S1～S2)，各品種AsA/DHA比值無(wú)明顯變化；之后，隨著AsA氧化還原程度不斷提高于葉片成熟期(S6)達(dá)到最高，此時(shí)‘亞德’、‘布勞德’和‘黑豐’的AsA/DHA比值依次為5.78、4.84和2.19，分別為幼葉時(shí)期(S1)的7.98、9.56和5.96倍；然后，隨著葉片的衰老，各品種葉片AsA/DHA比值顯著降低，說(shuō)明抗壞血酸氧化還原狀態(tài)與葉片的衰老密切相關(guān)。

同時(shí)，GSH/GSSG比值用來(lái)衡量谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)，通常使用GSH/GSSG比值變化來(lái)反映AsA-GSH循環(huán)在AsA生成中所起重要作用。GSH/GSSG越高意味GSH量越高，同時(shí)表明有越多DHA可通過(guò)DHAR和GSH作用轉(zhuǎn)化為AsA。在黑穗醋栗葉片整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，GSH/GSSG比值在3個(gè)品種葉片中均呈現(xiàn)相似的“M”型的變化模式(圖4，Ⅱ)，即表現(xiàn)出先上升后下降再上升再下降的趨勢(shì)。從品種間來(lái)看，‘亞德’葉片GSH/GSSG比值明顯要高于同期另外兩個(gè)品種。葉片由展開葉時(shí)期進(jìn)入到成熟葉時(shí)期時(shí)，其GSH/GSSG比值劇烈下降，說(shuō)明此時(shí)的GSH含量有下降趨勢(shì)，合成能力占據(jù)上風(fēng)，再生能力有所減緩；在展開葉時(shí)期(S3～S4)和成熟葉時(shí)期(S5～S6)，各品種葉片GSH/GSSG比值均有兩個(gè)峰值，之后隨著葉片的逐漸衰老而迅速降低。

圖4 黑穗醋栗不同品種葉片衰老過(guò)程中AsA/DHA和GSH/GSSG比值的變化Fig.4 Changes of AsA/DHA and GSH/GSSG ratios in different varieties of black currants during leaf senescence

2.4 各品種黑穗醋栗葉片衰老過(guò)程中GalLDH和AsA-GSH循環(huán)代謝相關(guān)酶活性的變化特征

2.4.1GalLDH活性GalLDH作為AsA主要合成途徑L-半乳糖途徑中最后一個(gè)關(guān)鍵酶，在很大程度上對(duì)AsA的生物合成起著調(diào)控作用。在黑穗醋栗葉片整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，3個(gè)品種葉片GalLDH活性變化趨勢(shì)相同(圖5)。在葉片發(fā)育初期，各品種葉片GalLDH活性相對(duì)較高，這也是葉片內(nèi)AsA含量迅速積累的時(shí)期；GalLDH活性從幼葉到成熟葉時(shí)期(S1～S6)過(guò)程中明顯上升，并均在成熟葉時(shí)期(S5)達(dá)到峰值；之后隨葉片的衰老，葉片GalLDH活性顯著下降，這與各品種葉片T-AsA和AsA含量的變化趨勢(shì)基本一致。其中，在成熟葉時(shí)期(S5)時(shí)，此時(shí)‘亞德’、‘布勞德’和‘黑豐’葉片GalLDH活性峰值分別為20.35、16.42和10.69 μmol·min-1·g-1，‘亞德’分別為‘布勞德’和‘黑豐’的1.24倍和1.90倍。從品種間來(lái)看，不同發(fā)育時(shí)期‘亞德’葉片GalLDH活性均高于其他兩個(gè)品種。

2.4.2AsA-GSH循環(huán)代謝相關(guān)酶活性3個(gè)黑穗醋栗品種葉片衰老過(guò)程中DHAR和MDHAR活性總體變化趨勢(shì)基本一致，均是先增加后降低(圖6，Ⅰ～Ⅱ)。3個(gè)品種葉片的DHAR活性在幼葉期(S1)均相對(duì)較低；之后迅速上升，‘亞德’葉片中DHAR活性在展開葉初期(S3)達(dá)到峰值(0.29 μmol·min-1·g-1)，而‘布勞德’和‘黑豐’DHAR活性均在展開葉時(shí)期(S4)達(dá)到最高，分別為0.54和0.61 μmol·min-1·g-1；隨后，各品種DHAR活性均隨著葉片衰老而降低，在衰老葉時(shí)期(S8)降到最低，衰老葉時(shí)期(S8)活性分別比展開葉時(shí)期(S4)下降了58.65%、59.57%和53.56%。同時(shí)，3個(gè)品種葉片的MDHAR活性均在展開葉初期(S3)達(dá)到最高值，分別為0.15、0.11和0.15 μmol·min-1·g-1，并在衰老葉時(shí)期(S8)降到最低；3個(gè)品種展開葉初期(S3)葉片的MDHAR活性分別為其衰老葉時(shí)期(S8)的6.06、6.62和7.20倍。相比較DHAR活性大小，3個(gè)品種不同生育時(shí)期葉片中MDHAR活性均低于DHAR活性。

圖5 黑穗醋栗不同品種葉片衰老過(guò)程中GalLDH活性的變化Fig.5 Changes of GalLDH activity in different varieties of black currants during leaf senescence

在葉片的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段，3個(gè)黑穗醋栗品種葉片的GR活性在展開葉時(shí)期(S4)最高，在衰老期(S8)降至最低(圖6，Ⅲ)。其中，從幼葉至展開葉時(shí)期(S1～S4)，3個(gè)品種GR活性隨著葉片的成熟而增加，之后其活性逐漸下降，‘亞德’、‘布勞德’和‘黑豐’在衰老葉時(shí)期(S8)葉片GR活性僅為展開葉時(shí)期(S4)的28.08%、32.34%和15.02%；3個(gè)品種葉片GR活性在展開葉時(shí)期(S4)后都要高于同期MDHAR活性，說(shuō)明在黑穗醋栗葉片生長(zhǎng)后期GR對(duì)葉片影響較大。

2.4.3APX活性AsA-GSH是AsA再生的主要系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，APX是植物AsA-GSH氧化還原途徑的重要組分，且是清除H2O2，特別是葉綠體中H2O2的關(guān)鍵酶。在黑穗醋栗葉片的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，3個(gè)品種葉片APX活性變化趨勢(shì)基本一致(圖6，Ⅳ)。在幼葉時(shí)期(S1)后，各品種葉片APX活性隨葉片葉齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，之后隨著葉片的衰老而降低，且APX活性明顯高于同期DHAR、MDHAR和GR活性(圖6，Ⅰ～Ⅳ)。其中，‘黑豐’、‘亞德’、‘布勞德’葉片APX活性均在成熟葉時(shí)期(S5)達(dá)到最高值，均在衰老葉時(shí)期(S8)中活性降到最低值，它們?nèi)~片APX活性最高值分別為3.32、2.97和1.39 μmol·min-1·g-1，最低值比最高值分別下降了78.82%、78.54%和77.81%。葉片APX活性的降低有助于確保AsA含量的積累與穩(wěn)定。

2.5 各品種黑穗醋栗葉片衰老過(guò)程中H2O2含量的變化特征

H2O2是對(duì)植物具毒害作用的活性氧，是體內(nèi)及體外光合電子傳遞鏈的天然產(chǎn)物。同時(shí)H2O2可能是啟動(dòng)葉片衰老的一個(gè)重要因子。3個(gè)黑穗醋栗品種葉片H2O2含量在葉片發(fā)育過(guò)程中的變化趨勢(shì)相一致，均是隨著葉齡的增加而呈逐漸上升趨勢(shì)，并且這3個(gè)品種之間H2O2含量差別也很小(圖7)。其中，從幼葉時(shí)期到展開葉時(shí)期(S1～S4)，生育期之間H2O2含量差異不大；在成熟葉時(shí)期(S5)，‘亞德’、‘布勞德’和‘黑豐’葉片H2O2含量分別為1.32、1.39和1.03 μmol/g，比相應(yīng)幼葉時(shí)期(S1)分別上升了39.02%、58.58%和43.22%；而到了衰老葉時(shí)期(S8)，各品種葉片中H2O2含量均達(dá)到最高值，分別為相應(yīng)幼葉時(shí)期(S1)H2O2含量的2.75、4.33和3.74倍?？梢?jiàn)，黑穗醋栗葉片的衰老可能與葉片中H2O2的大量積累有密切聯(lián)系；同時(shí)，由于H2O2的清除需要APX以AsA作為電了供體，因此推測(cè)黑穗醋栗衰老葉片H2O2的大量積累可能與AsA含量、APX活性降低有關(guān)。

圖6 黑穗醋栗不同品種葉片衰老過(guò)程中DHAR、MDHAR、GR和APX活性的變化Fig.6 Changes of DHAR, MDHAR, GR and APX activities in different varieties of black currants during leaf senescence

圖7 黑穗醋栗不同品種葉片衰老過(guò)程中H2O2含量的變化Fig.7 Changes of H2O2 content in different varieties of black currants during leaves senescence

2.6 黑穗醋栗葉片衰老過(guò)程中AsA合成代謝相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性

黑穗醋栗品種‘亞德’葉片衰老過(guò)程中相關(guān)酶活性和葉片中AsA含量相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示，另外兩個(gè)品種與‘亞德’類似，故不全部列舉。結(jié)果表明，在‘亞德’葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，GSSG含量與T-AsA、AsA和DHA含量呈顯著正相關(guān)；GSH/GSSG與T-AsA和AsA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與GSSG含量存在極顯著負(fù)相關(guān)。GalLDH活性與T-AsA、AsA、DHA含量和DHAR、MDHAR活性呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)，而與T-GSH和GSSG含量呈顯著正相關(guān)，與AsA/DHA、GSH/GSSG顯著負(fù)相關(guān)，即葉片中GalLDH活性越高，葉片中AsA含量也越高，說(shuō)明GalLDH可能是AsA合成關(guān)鍵酶。同時(shí)，在AsA-GSH循環(huán)代謝相關(guān)酶中，DHAR活性與T-AsA、AsA和DHA含量以及MDHAR均呈極顯著正相關(guān)。GR活性與GSSG含量呈顯著正相關(guān)，與GSH/GSSG呈顯著負(fù)相關(guān)，GR活性隨GSH含量升高而降低，可能存在GSH對(duì)GR的反饋抑制。而APX活性與其他指標(biāo)相關(guān)性均不顯著。

3 討 論

植物衰老是由內(nèi)部因素控制，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段都可以發(fā)生，受外部因素影響導(dǎo)致植物自然死亡的一系列衰退過(guò)程，對(duì)發(fā)育生物學(xué)有著重要的作用[15]。在植物進(jìn)入衰老時(shí)期時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，而植物體內(nèi)的活性氧(ROS)消除系統(tǒng)的活性下降，就會(huì)使植物自由基的產(chǎn)生、消除平衡受到破壞。近年來(lái)研究表明，作為植物非保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組分，AsA在清除活性氧自由基及抗氧化方面具有非常重要的生理功能，植物體內(nèi)較高的AsA水平將有助于提高抗逆境脅迫的能力。它可以直接清除一些活性氧自由基，并通過(guò)AsA-GSH循環(huán)來(lái)間接清除H2O2，減輕其對(duì)植物的傷害[16-17]。H2O2被認(rèn)為是一種導(dǎo)致植物氧化脅迫的活性氧分子和植物細(xì)胞應(yīng)答環(huán)境變化所產(chǎn)生的重要信號(hào)分子[18]。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，其生長(zhǎng)狀況的好壞直接影響著光合作用的效率和光合產(chǎn)物的積累，進(jìn)而影響產(chǎn)量。生長(zhǎng)旺盛的葉片，其內(nèi)部各種生理代謝協(xié)調(diào)，尤其是活性氧的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)之間的平衡，該平衡系統(tǒng)調(diào)控著葉片的衰老與否。本研究結(jié)果表明，在黑穗醋栗葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，隨著葉片的衰老，H2O2的含量不斷增加，并在衰老期(S8)達(dá)到最高，在蘋果[1]、玉米[19]和水稻[20]等植物中葉也有相同的研究結(jié)果。H2O2含量增加導(dǎo)致以AsA為核心的代謝相關(guān)酶活性迅速增強(qiáng)，AsA及AsA庫(kù)含量也逐漸增加，同時(shí)APX活性增強(qiáng)，AsA參與H2O2的清除被大量消耗，而其最終產(chǎn)物DHA含量隨著葉片葉齡的增加下降幅度很小，致使AsA/DHA比值快速降低。

AsA是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)，不同物種間其含量差異很大，即使同一物種不同品種間AsA含量也存在差異，甚至在同一植物的不同組織器官AsA含量也有所不同[21]。目前研究表明很多植物的綠色光合組織器官中AsA含量比果實(shí)還高，可能是這些器官通常會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧物質(zhì)，需要更高含量的AsA來(lái)處理。如雙子葉模式植物擬南芥葉片的AsA含量為5 μmol/g，單子葉模式植物水稻葉片的AsA含量為6 μmol/g。高山植物與溫帶常綠植物通常也有較高的AsA積累，比如高山植物的高山圓幣草(Soldanellaalpina)葉片的AsA含量高達(dá)30 μmol/g，是陸地植物的5～10倍[5]。而黑穗醋栗也是這其中的一種，本試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)不同黑穗醋栗品種葉片AsA含量與T-AsA含量表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，均是在成熟葉時(shí)期(S6)達(dá)到最高，之后隨著葉片的衰老而下降，且在不同葉齡葉片中含量有顯著差異；DHA含量隨著葉片的衰老一直有所降低，并在衰老葉期(S8)降至最低；從而引起黑穗醋栗葉片中AsA/DHA在成熟葉期(S6)達(dá)到最高，之后隨著葉片的不斷衰老而下降。這與在蘋果葉片衰老過(guò)程中相關(guān)研究結(jié)果類似，但與刺梨葉片衰老過(guò)程中相關(guān)研究結(jié)果存在一些差異[22]，這可能與物種不同有關(guān)。

AsA-GSH循環(huán)作為植物體內(nèi)主要抗氧化系統(tǒng)，可以抑制活性氧的產(chǎn)生，在植物衰老過(guò)程中起著重要作用[23]。在本試驗(yàn)中，DHAR和MDHAR活性與AsA含量和AsA的氧化還原勢(shì)變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明DHAR和MDHAR活性對(duì)于維持AsA水平及氧化還原狀態(tài)有著重要作用，同時(shí)也說(shuō)明了DHAR和MDAHR活性是影響黑穗醋栗葉片AsA含量的決定因素之一。進(jìn)一步相關(guān)性分析表明DHAR與MDHAR呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明AsA循環(huán)再生酶可能隨著一種酶活性的變化而相應(yīng)變化，這與在柑橘[24]、蘋果[1]中的研究結(jié)果相一致。隨著黑穗醋栗葉片的成熟與衰老，葉中GSH含量和GR活性下降，而AsA含量也降低，表明GSH和GR有助于葉片中AsA的積累；而同時(shí)APX活性與AsA含量變化趨勢(shì)基本相反，呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)，另外，本研究中黑穗醋栗葉片APX活性明顯高于同期其他酶活性，可有效防止活性氧(ROS)對(duì)細(xì)胞的毒害，這與在甜櫻桃[25]中的研究結(jié)果相一致。AsA再生能力隨葉片的衰老而下降，DHAR、MDHAR、GR活性的下降與AsA含量的下降相關(guān)，這說(shuō)明可以通過(guò)增強(qiáng)再生酶的活性來(lái)提高植物AsA的積累[26]，調(diào)控其循環(huán)代謝過(guò)程，進(jìn)而延緩植物衰老、增加植物抗逆性。比如，有研究表明過(guò)量表達(dá)GR不僅能提高GSH的水平而且可以增加AsA含量，還能提高植物對(duì)逆境的抗性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)GSH是一種有效的活性氧清除劑，能夠延緩棉花葉片的衰老[27]，還能阻止離體水稻葉片的衰老[28]。

作為在L-半乳糖途徑中的關(guān)鍵酶GalLDH，它的有無(wú)是植物是否能自身合成AsA的前提[29]，刺梨中AsA含量的積累與GalLDH活性存在著明顯的正相關(guān)關(guān)系[30]，同樣棗和酸棗中GalLDH活性與AsA含量存在一定的相關(guān)性[31]。本試驗(yàn)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)‘亞德’葉片GalLDH活性與AsA含量的變化呈正相關(guān)，這與在梨[32]、馬鈴薯[33]中的研究結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)，蘋果不同葉齡葉片中GalLDH活性變化趨勢(shì)與AsA含量的變化基本一致，且AsA含量主要依賴于AsA的生物合成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GalLDH對(duì)AsA合成有一定的調(diào)控能力[21]；馬鈴薯的GalLDH在不同器官中基因表達(dá)量變化與AsA含量的變化高度一致[34]；同樣，GalLDH過(guò)量表達(dá)能顯著提高煙草中AsA含量[35]。在本研究中，黑穗醋栗葉片GalLDH活性從幼葉時(shí)期到成熟葉時(shí)期(S1～S6)明顯上升，之后隨葉片的衰老顯著下降，這與T-AsA和AsA含量的變化趨勢(shì)基本一致，而且‘亞德’葉片GalLDH活性比另外兩個(gè)品種要高，這也進(jìn)一步證明了GalLDH活性的高低可能是影響黑穗醋栗品種間葉片AsA含量差異的重要原因，也就可以解釋為何‘亞德’AsA含量比‘布勞德’和‘黑豐’高，進(jìn)而可以推測(cè)GalLDH可能在AsA合成過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用。

綜上所述，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑穗醋栗葉片GalLDH活性變化趨勢(shì)與其AsA含量變化一致，且GalLDH和DHAR活性與AsA含量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，所以推測(cè)GalLDH和DHAR可能是黑穗醋栗葉片AsA合成代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可以通過(guò)提高其酶活性來(lái)提高葉片中AsA含量，進(jìn)而延緩葉片衰老，達(dá)到增強(qiáng)植株抗性的目的，為后期黑穗醋栗葉片的開發(fā)利用及研究黑穗醋栗AsA積累機(jī)制提供依據(jù)。