夏 楊，蘇初連，晁 駿，康 浩，蒲金基，2，張 賀*

(1 海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228；2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?71101)

VOZ(vascular plant one-zinc finger protein)即維管植物鋅指蛋白，它是一類廣泛存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，與植物的進(jìn)化和發(fā)育密切相關(guān)。在擬南芥中，VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族包含2個(gè)成員，分別稱為AtVOZ1和AtVOZ2，AtVOZ1和AtVOZ2的同源物被發(fā)現(xiàn)存在于各種維管植物以及小立碗蘚中[1]，它們能與V-PPase(Vacuolepyrophosphatase)AVP1啟動(dòng)子中的38 bp順式作用區(qū)域結(jié)合[2]，AtVOZ1在韌皮部組織中特異性表達(dá)，而AtVOZ2在根部強(qiáng)烈表達(dá)。研究表明，擬南芥的AtVOZ1和AtVOZ2轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到開花的過渡，Atvoz1Atvoz2雙突變體在長(zhǎng)日照條件下表現(xiàn)出推遲開花的表型[3]。在水稻中，OsVOZ1受包括干旱、低溫、高溫、高鹽等在內(nèi)的多種逆境的誘導(dǎo)表達(dá)，而且在不同的組織中，該基因的表達(dá)也存在明顯的差異，在莖和葉中的表達(dá)要明顯高于根中。與此同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)該基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)高鹽有一定的表型[4]。在齒肋赤蘚中，ScVOZ1具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能和核定位潛力，且與AtVOZ1具有高度的相似性[5]。

菠蘿 (Ananascomosus)屬鳳梨科鳳梨屬，原名鳳梨。原產(chǎn)美洲熱帶和亞熱帶，性喜溫暖，最適生長(zhǎng)的年均氣溫為24～27 ℃。15 ℃以下生長(zhǎng)緩慢，5 ℃是受凍的臨界溫度，43 ℃高溫即停止生長(zhǎng)。性耐旱，需一定水分，年降雨量需1 000～1 500 mm且分布均勻?yàn)橐?。中?guó)是菠蘿十大主產(chǎn)國(guó)之一，主要種植在廣東、海南、廣西、福建、云南等省[6]。近年來，在許多地區(qū)，干旱和鹽漬化面積迅速擴(kuò)張，估計(jì)到2050年將有50%可耕地面積嚴(yán)重鹽漬化[7]。干旱、鹽堿、極端溫度等非生物脅迫能夠?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重的危害[8]，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，是引起全球糧食作物減產(chǎn)的首要原因[9]。諸如干旱、鹽堿、極端溫度等非生物脅迫嚴(yán)重危害著菠蘿生產(chǎn)，進(jìn)而制約菠蘿產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，因而有必要運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)開展菠蘿的花果調(diào)控、抗旱耐寒性新品種選育。

1 材料和方法

1.1 菠蘿非生物脅迫處理

將株高約10 cm均勻一致的菠蘿組培苗，移栽于花盆中，置于25 ℃溫室中，以相對(duì)濕度約80%、14 h光照/10 h黑暗光周期下進(jìn)行脅迫處理，每個(gè)處理10株組培苗，以0 h處理為對(duì)照。

以300 mmol/L NaCl溶液、20%PEG6000溶液、200 mmol/L甘露醇溶液、100 mmol/L雙氧水(H2O2)溶液分別淋灌菠蘿組培苗，干旱處理以菠蘿組培苗自然失水6%時(shí)、移植缺水基質(zhì)后，分別于0、12、24、48、72、96和120 h取樣；以15 mmol/L乙烯利(Eth)溶液、0.5 mmol/L水楊酸(SA)溶液、0.5 mmol/L脫落酸(ABA)溶液分別淋灌菠蘿組培苗，以及4 ℃低溫處理菠蘿組培苗，48 h后移至25 ℃溫室中，分別于0、1、3、6 、12、24和72 h取樣；剪取菠蘿葉，液氮速凍，-80 ℃保存、備用。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取與cDNA第1鏈的合成參照天根生化科技有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒中的方法提取菠蘿的總RNA。使用超微量紫外分光光度計(jì)(Nano-drop 2000C型)測(cè)定總RNA的濃度，-80 ℃保存，備用。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成第1鏈cDNA，10倍稀釋后備用。

1.2.2菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族基因的擴(kuò)增根據(jù)Plant Transcription Factor Databasev4.0(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)[10]中菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族的相關(guān)信息，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物AcoVOZ1-F / AcoVOZ1-R和AcoVOZ2-F/AcoVOZ2-R(表1)，以菠蘿葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火40s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.3菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析通過DNAMAN6.0軟件進(jìn)行高同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)，并對(duì)菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)域進(jìn)行分析。通過ExPASy蛋白分析專家系統(tǒng)[11](Expert Protein Analysis System，https://www.expasy.org/)提供的蛋白質(zhì)在線分析工具ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均親水性等理化性質(zhì)，利用PSORT(https://psort.hgc.jp/)在線工具預(yù)測(cè)菠蘿VOZ蛋白的亞細(xì)胞定位。通過在線工具SOPMA(https://www.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族的差異表達(dá)分析為研究不同非生物脅迫下菠蘿VOZ家族基因的差異表達(dá)情況，利用Quant Studio 6 Flex的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，采用UltraSYBR Mixture試劑盒(北京康為世紀(jì))作為熒光試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作。建立10 μL的反應(yīng)體系，每個(gè)處理樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；在60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。根據(jù)AcoVOZ1和AcoVOZ2基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物qAcVOZ1-F/qAcVOZ1-R和qAcVOZ2-F/qAcVOZ2-R(表1)。以菠蘿Actin基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物qAcoActF / qAcoActR。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件(QuantStudioTM6 Flex)獲得各個(gè)樣品的Ct值，以0 hpi的表達(dá)量為對(duì)照，運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并對(duì)數(shù)據(jù)采用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析[12]，確定AcoVOZ1、AcoVOZ2的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族基因擴(kuò)增

PlantTFDB 4.0顯示，菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族有2個(gè)成員，分別為AcoVOZ1和AcoVOZ2。AcoVOZ1基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 542 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼513個(gè)氨基酸；AcoVOZ2基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 782 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼593

個(gè)氨基酸。以菠蘿葉片cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增得到的AcoVOZ1擴(kuò)增產(chǎn)物約1 500 bp，AcoVOZ2擴(kuò)增產(chǎn)物約1 800 bp(圖1)，與預(yù)期大小相一致。

2.2 菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族特征結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN對(duì)菠蘿AcoVOZ1(Aco000305.1)和AcoVOZ2(Aco005321.1)、擬南芥AtVOZ1(AT1G28520.1、AT1G28520.2)和AtVOZ2(AT2G42400.1)、水稻OsVOZ1(LOC_Os01g54930.1)和OsVOZ2(LOC_Os05g43950.1)的VOZ基因編碼的蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)AcoVOZ1、AcoVOZ2與擬南芥、水稻的VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族存在相似的2個(gè)保守域A和B。菠蘿AcoVOZ1的保守域A由約87個(gè)氨基酸殘基組成，位置為27～113，B由約217個(gè)氨基酸殘基組成，位置為221～437；AcoVOZ2保守域A由約83個(gè)氨基酸殘基組成，位置為129～211，B由約206個(gè)氨基酸殘基組成，位置為325～530。多重序列比對(duì)分析結(jié)果顯示B的氨基酸殘基Lys(K)和Leu(L)高度保守(圖2)。

M. DL2000； 1. AcoVOZ1；2. AcoVOZ2；NC.陰性對(duì)照?qǐng)D1 菠蘿VOZ家族基因的擴(kuò)增M.DL2000；1. AcoVOZ1；2. AcoVOZ2；NC. Negative controlFig.1 Amplification of VOZ genes from pineapple

AcoVOZ1、AcoVOZ2.菠蘿；AtVOZ1、AtVOZ2.擬南芥；OsVOZ1、OsVOZ2.水稻圖2 菠蘿與擬南芥、水稻VOZ家族特征結(jié)構(gòu)域的多重序列比對(duì)AcoVOZ1, AcoVOZ2. Pineapple; AtVOZ1, AtVOZ2. Arabidopsis; OsVOZ1, OsVOZ2. RiceFig.2 Multiple sequence alignment of VOZ family in pineapple, Arabidopsis and rice

2.3 菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

通過ExPaSy-ProtParam Tool對(duì)AcoVOZ1、AcoVOZ2編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，AcoVOZ1編碼的蛋白質(zhì)分子式為C2497H3897N715O769S17，相對(duì)分子質(zhì)量為56.78 kD，等電點(diǎn)為5.97，不穩(wěn)定系數(shù)為55.18，脂肪系數(shù)為74.62，親水平均數(shù)為-0.586；AcoVOZ2編碼的蛋白質(zhì)分子式為C2883H4453N811O899S17，相對(duì)分子質(zhì)量為65.40 kD，等電點(diǎn)為5.36，不穩(wěn)定系數(shù)為45.47，脂肪系數(shù)為73.17，親水平均數(shù)為-0.547。因此，預(yù)測(cè)這2個(gè)蛋白都為不穩(wěn)定親水酸性蛋白。

利用PSORT對(duì)AcoVOZ1和AcoVOZ2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，AcoVOZ1蛋白定位于細(xì)胞核的可能性為47.8%，AcoVOZ2蛋白定位于細(xì)胞核的可能性為69.6%，表明AcoVOZ1和AcoVOZ2定位于細(xì)胞核內(nèi)。

2.4 菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過在線分析工具SOPMA 對(duì)AcoVOZ1、AcoVOZ2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明(圖3)，AcoVOZ1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件是α-螺旋(39.77%)和無規(guī)則卷曲(38.79%)，其次是延伸鏈(12.28%)和β-轉(zhuǎn)角(9.16%)；AcoVOZ2的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件是無規(guī)則卷曲(40.3%)和α-螺旋(38.28%)，其次是延伸鏈(13.32%)和β-轉(zhuǎn)角(8.09%)。

橫坐標(biāo)表示氨基酸序列位點(diǎn)圖3 菠蘿VOZ家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)The abscissa indicates the position of the amino acid sequence.Fig.3 Secondary structure prediction of VOZ family in pineapple

圖4 菠蘿VOZ家族保守域A和B的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Tertiary structure prediction of domain A and B of VOZ family in pineapple

基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL軟件對(duì)菠蘿AcoVOZ1、AcoVOZ2和擬南芥AtVOZ1(AT1G28520.1)、AtVOZ2(AT2G42400.1)蛋白中保守域A和B的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，在保守域A中，AcoVOZ2含有3個(gè)螺旋—環(huán)—螺旋結(jié)構(gòu)，而AcoVOZ1只有1個(gè)螺旋—環(huán)—螺旋結(jié)構(gòu)；在保守域B中，AcoVOZ1與AcoVOZ2結(jié)構(gòu)類似，根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能的原理，推測(cè)AcoVOZ1與AcoVOZ2功能上也具有相似性。

2.5 不同非生物脅迫下菠蘿VOZ家族基因的表達(dá)分析

以菠蘿Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，0 h處理為空白對(duì)照組。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)并分析了不同非生物脅迫下菠蘿VOZ家族基因的表達(dá)程度。

鹽(NaCl)脅迫條件下(圖5，A)，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達(dá)量呈顯著下降趨勢(shì)，并在48 h之后趨于穩(wěn)定，整個(gè)過程中AcoVOZ1的表達(dá)量均高于AcoVOZ2；PEG6000脅迫條件下(圖5，B)，在處理12 h后，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達(dá)量均明顯上升，其中AcoVOZ1的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的2.6倍，隨后均顯著下降，但AcoVOZ1在120 h時(shí)顯著升高至對(duì)照的2.8倍；甘露醇脅迫條件下(圖5，C)，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達(dá)量呈顯著下降趨勢(shì)，并在24 h之后趨于穩(wěn)定；H2O2脅迫條件下(圖5，D)，在處理12 h后，AcoVOZ1表達(dá)量明顯上升，隨后下降，在48 h時(shí)上升至對(duì)照組的6.5倍，隨后下降，而AcoVOZ2在H2O2處理后的表達(dá)量顯著下降，隨后在48 h時(shí)陡然上升后迅速下降，最后恢復(fù)至處理前水平；干旱脅迫條件下(圖5，E)，在處理12 h后，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達(dá)量均明顯下降，并在24 h后趨于穩(wěn)定。

乙烯利(Eth)脅迫條件下(圖5，F(xiàn))，在處理1 h后，AcoVOZ1的表達(dá)量明顯下降并趨于穩(wěn)定，在72 h時(shí)陡然上升，且達(dá)到對(duì)照的3.2倍，而在Eth處理后AcoVOZ2的表達(dá)量顯著下降并趨于平穩(wěn)；水楊酸(SA)脅迫條件下(圖5，G)，在處理1 h后，AcoVOZ1的表達(dá)量顯著上升至對(duì)照的3.4倍，并在6 h恢復(fù)至處理前水平，而在SA處理后AcoVOZ2的表達(dá)量顯著下降并趨于平穩(wěn)；脫落酸(ABA)脅迫條件下(圖5，H)，AcoVOZ1的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，而AcoVOZ2的表達(dá)量迅速下降，隨后在12 h時(shí)上升后緩慢下降，但總體低于對(duì)照水平；低溫(4 ℃)脅迫條件下(圖5，I)，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達(dá)量呈明顯下降趨勢(shì)，整個(gè)過程中AcoVOZ1的表達(dá)量均高于AcoVOZ2。

*表示在處理與對(duì)照0.05水平上差異顯著圖5 菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族在不同非生物脅迫下的表達(dá)* indicates significant difference between treatments and control at 0.05 levelFig.5 Expression analysis of VOZ transcription factors in pineapple under different abiotic stress treatments

3 討 論

植物遇到干旱、鹽堿、極端低溫等非生物脅迫時(shí)，可以在生理生化和細(xì)胞水平上產(chǎn)生響應(yīng)，以適應(yīng)或忍耐環(huán)境脅迫，實(shí)現(xiàn)正常的生長(zhǎng)發(fā)育，確保作物產(chǎn)量和質(zhì)量[13]。在這個(gè)響應(yīng)過程中，轉(zhuǎn)錄因子能夠與逆境脅迫相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域的作用元件結(jié)合，正向或負(fù)向調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[14]，VOZ轉(zhuǎn)錄因子便是其中一類。VOZ轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在擬南芥[15]、水稻、苔蘚中得到鑒定，并在調(diào)控非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。

本研究通過生物信息學(xué)方法，分析了菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等信息，表明AcoVOZ1和AcoVOZ2蛋白都為不穩(wěn)定親水酸性蛋白，與擬南芥、水稻VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，VOZ蛋白均包含2個(gè)保守域，且保守域B在三級(jí)結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，推測(cè)它們?cè)诠δ苌弦彩窒嗨?。qRT-PCR結(jié)果顯示，在不同非生物脅迫下，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達(dá)量與對(duì)照差異顯著，這表明AcoVOZ1和AcoVOZ2對(duì)非生物脅迫有響應(yīng)。Nakai等[16]研究認(rèn)為擬南芥中VOZ蛋白調(diào)節(jié)各種逆境，許多與逆境相關(guān)的基因在正常生長(zhǎng)狀況下發(fā)生了改變，與逆境應(yīng)答基因的改變相一致，抗凍性和抗旱性在雙突變體voz1voz2中増加，這與本研究結(jié)果較為類似。但擬南芥的VOZ基因的雙突變體voz1voz2對(duì)病原真菌和病原細(xì)菌的抗性卻受到了嚴(yán)重的抑制，這可能與非生物脅迫與生物脅迫的機(jī)理不同有關(guān)。

植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)極為復(fù)雜，非生物脅迫引起的植物生理生化指標(biāo)改變由植物體內(nèi)的保護(hù)系統(tǒng)和相關(guān)基因表達(dá)共同調(diào)控的，且基因的表達(dá)具有組織特異性[17]。本研究中，在鹽(NaCl)、干旱、低溫(4 ℃)、甘露醇、脫落酸(ABA)、乙烯利(Eth)脅迫下，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達(dá)量均呈顯著下降趨勢(shì)，推測(cè)它們以負(fù)調(diào)控機(jī)制響應(yīng)鹽(NaCl)、干旱、低溫(4 ℃)等非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。Nakai等[18]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，過度表達(dá)VOZ2損害了冷凍和干旱脅迫的耐受性，即損害了非生物脅迫的耐受性，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果較為類似。

本研究初步確定了菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員對(duì)鹽(NaCl)、干旱、低溫(4 ℃)等非生物脅迫中的響應(yīng)效應(yīng)，表明它們?cè)谡{(diào)控非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。以上研究，加深了對(duì)菠蘿非生物脅迫分子水平上的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為后續(xù)對(duì)菠蘿VOZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員的功能和作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。