蘇麗艷

(西安文理學院 生物與環(huán)境工程學院 秦嶺野生觀賞植物研究中心，西安 710065)

草莓屬于薔薇科草莓屬水果，富含維生素C、A、E、B1及礦物質(zhì)、膳食纖維等多種營養(yǎng)成分而廣受歡迎?，F(xiàn)代分子生物學和生物信息學技術(shù)的發(fā)展以及草莓基因組測序的完成，為研究和揭示草莓生長和發(fā)育的分子機理提供了豐富的信息資源。草莓果實是由植物花器官中的子房，通過授粉或生長素、赤霉素等條件刺激后，進一步分裂膨大而形成[1-3]。生長素作為調(diào)控果實生長發(fā)育的重要植物激素之一，對草莓的花誘導控制及其授粉后果實的生長發(fā)育過程有重要調(diào)控作用[4-6]。生長素響應因子(auxin response factors，ARFs)是介導生長素信號轉(zhuǎn)導的重要蛋白家族之一，研究草莓中ARFs家族基因的功能，對探索生長素在花及果實發(fā)育過程中的作用具有重要意義[7-8]。

生長素信號通路中, 生長素可能通過影響ARFs 和Aux/IAA (auxin/indole-3-acetic acid)蛋白的互作調(diào)控早期響應基因的表達[9]。ARFs是一類響應生長素應答的轉(zhuǎn)錄因子，能和Aux/IAA的啟動子響應元件(AuxREs)TGTCTC 特異結(jié)合[10-11]。研究表明，在低濃度生長素條件下，ARFs與Aux/IAA結(jié)合，抑制生長素誘導基因表達；當生長素濃度升高后，生長素受體(TIR/AFBs)與生長素結(jié)合后會大大增強與Aux/IAA結(jié)合能力，導致Aux/IAA泛素化而被26S蛋白酶體降解，使ARF從ARF-Aux/IAA二聚體中游離出來，從而激活生長素響應[12-13]。研究表明，擬南芥AtARF16與AtARF10基因同屬一個亞家族，兩者同為擬南芥At-miR160基因的靶基因，對于植株根冠細胞的分裂和分化水平有重要調(diào)控作用，為維持植株正常生長發(fā)育所必須[14], 同時，有研究證明楊樹中Pto-ARF16與Pto-miR160a互作調(diào)控木材的形成過程[15]。另外，敲除大豆GmARF16基因后，大豆葉片葉綠素含量及最大光量子效率 (Fv/Fm) 顯著提高，而葉片衰老相關(guān)基因表達受到抑制，從而證明GmARF16正調(diào)控葉片衰老進程[16]。近年來，越來越多研究關(guān)注ARFs家族基因?qū)τ诠麑嵉纳L發(fā)育的調(diào)控作用[17-20]。目前，在番茄中分離得到22個ARFs基因[20]，在葡萄中分離得到19個ARFs基因[21]，甜橙ARFs家族包含19個成員[22], 香蕉中有47個ARFs基因[23]。部分成員的功能已經(jīng)展開了深入研究分析，例如arf1/arf2雙突變體植株的研究表明ARF2對于葉片和花器官的衰老有重要調(diào)控作用[24]，而arf8突變導致番茄果實的單性結(jié)實，其對于番茄的坐果和果實發(fā)育有重要意義[25]。目前，以番茄為模式植物已經(jīng)證明，越來越多的ARF家族基因參與調(diào)控果實的早期發(fā)育、細胞分裂、坐果、成熟和品質(zhì)形成過程[26-34]，這為解析生長素調(diào)控果實生長發(fā)育的分子機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。盡管ARFs已在很多物種中得到分離和鑒定，但其在草莓果實發(fā)育過程中的功能尚無相關(guān)報道。

本研究以森林草莓(Fragariavesca)為研究材料，克隆得到草莓生長素響應因子家族FvARF10和FvARF18基因，詳細分析FvARF10和FvARF18的保守結(jié)構(gòu)域、進化關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)和啟動子應答元件，并研究其在不同組織中的表達情況及其對外源IAA處理的應答情況，為深入研究草莓FvARF家族蛋白的功能提供參考，同時也為其他果類和瓜類蔬菜果實發(fā)育分子調(diào)控機制的研究提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

森林草莓(Fragariavesca)材料由西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供。植株栽種于西安文理學院溫室中，于生長盛期分別取根、莖、葉、當天開放的花朵、青果(花后11～12 d)、半熟果(花后20～21 d)、紅果(花后25～26 d)，液氮冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

外源IAA處理方法參考文獻[31]。選取長勢良好的草莓盆栽30盆，分為2組，每組15盆。一組為IAA處理，用50 mg/L IAA溶液200 mL灌根；另一組為對照，用等量清水灌根。分別于處理后0、1、6和 12 h隨機取葉片(每次約8片單葉)。每個處理3次重復。植物材料液氮冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 方 法

1.2.1基因克隆與序列分析利用去多糖多酚RNA提取試劑盒(北京天根)提取森林草莓不同組織樣品RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaRaKa 公司)合成cDNA。利用Phytozome數(shù)據(jù)庫中提交的森林草莓(Fragariavesca)數(shù)據(jù)庫，通過與擬南芥At-ARFs家族基因同源序列比對，克隆FvARF10和FvARF18基因，根據(jù)其ORF序列設(shè)計特異性引物(表1)進行PCR擴增。PCR 反應條件為94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 35個循環(huán); 最后72 ℃延伸7 min?；厥誔CR 產(chǎn)物并連接到pMD18-T 載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進行鑒定后，送往上海生物工程有限公司進行DNA測序。

1.2.2序列分析不同植物相關(guān)基因及氨基酸序列來自 NCBI 數(shù)據(jù)庫；利用 DNAMAN 進行氨基酸序列比對；利用在線軟件 ProtParam(http：//web. expasy.org/protparam/)計算蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點；利用TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進行FvARF10、FvARF18蛋白的亞細胞定位預測；啟動子順式作用元件分析采用在線工具plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)進行。利用 MEGA 5 軟件進行系統(tǒng)進化樹分析，并生成報告圖形。

1.2.3FvARF10、FvARF18表達特性分析以不同組織和IAA處理材料cDNA為模板進行實時熒光定量 PCR 分析。以草莓Fv18S為內(nèi)參基因，設(shè)計FvARF10和FvARF18特異性引物(表1)進行實時熒光定量PCR分析。操作步驟按照FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) 試劑盒說明書進行。qPCR體系為20 μL，包括10 μL SYBR premix混合液，1 μL cDNA (稀釋至 30 ng/μL)，引物各1 μL (10 μmol/L)，ddH2O 7 μL。反應程序為：95 ℃

變性3 min；然后，95 ℃ 20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 次循環(huán)；每次循環(huán)第3 步進行熒光采集，最后退火至65 ℃，每隔30 s 上升0.5 ℃，至95 ℃變性1 min。qRT-PCR 反應于ABI Quant Studiotm6 Flex Real-Time PCR System上進行。cDNA樣品均3 次生物樣本重復。試驗結(jié)果用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行定量分析，方法同文獻[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 FvARF10和FvARF18的克隆和序列分析

以森林草莓葉片cDNA為模板，經(jīng)PCR 擴增，獲得FvARF10和FvARF18基因片段, 瓊脂糖凝膠電泳顯示與目標條帶大小一致(圖1)。對擴增結(jié)果進行測序和分析后表明，F(xiàn)vARF10和FvARF18基因片段大小依次為2 056和2 100 bp，分別編碼685和699個氨基酸。預測其分子量和等電點分別為75.73、76.78 kD和 8.12、6.55。保守結(jié)構(gòu)域預測分析表明FvARF10和FvARF18均含有保守的B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生長素響應因子保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖1 森林草莓FvARF10和FvARF18基因克隆Fig.1 Amplification of FvARF10 and FvARF18 genes from Fragaria vesca

用途Use引物名稱Primer name引物序列Sequence(5'→3')ORF擴增Complete ORF amplificationFvARF18-FATGGATGCGAAAGAGAAATTGFvARF18-RTTACATTCCTACATTGTTGCTGFvARF10-FATGGAGAAAACATTAGATCCTCAGCFvARF10-RTTACCTCCCAATAGTTTCATTTGC熒光定量PCRFluorescent quantitative PCRRQ-FvARF18-FTGGAGATGAACCATTCAGTGACRQ-FvARF18-RCATTGTTGCTGCCTGAATCCATRQ-FvARF10-FCGCCGGAGTTTTGTGTGAAGRQ-FvARF10-RCTCATCCCTGAGCACCACTGRQ-Fv18S-FACCGTTGATTCGCACAATTGGTCATCGRQ-Fv18S-RTACTGCGGGTCGGCAATCGGACG

圖2 森林草莓FvARF10和FvARF18保守結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.2 Putative conserved domain structure and schematic model for FvARF10 and FvARF18

2.2 FvARF10、FvARF18基因的同源序列比對和進化分析

利用DNAman 軟件將克隆FvARF10和FvARF18氨基酸序列與其他物種ARFs進行同源比對(圖4)，B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生長素響應因子保守結(jié)構(gòu)域所在位置高度保守。進化樹分析表明(圖3)，F(xiàn)vARF18與桑樹MnARF18聚集在一個分支上，而FvARF10與苧麻BnARF10進化關(guān)系較密切。

圖3 森林草莓FvARF10和FvARF18系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 The phylogenetic relationships of FvARF10 and FvARF18 from various organisms

AtARF16、AtARF17. 擬南芥(At4g30080 and At1g77850); BnARF10. 苧麻(AMO02493)；CaARF8.甜辣椒(PHT71835)；CsARF10.茶樹(AGH32871)；FvARF10、FvARF18.森林草莓(mrna16844和mrna09733)； HuARF18.錦葵(XP_021296004)；MnARF18.桑樹(XP_010107532)；PpARF18.桃樹(XP_020414283)；PtARF10.毛果楊(XP_002313508)；SlARF10、SlARF16.、SlARF17.番茄(NP_001234796、HM195247.1和HQ456923)；TcARF19.可可(EOY07838)單黑線標記為B3 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，雙黑線為生長素響應因子保守結(jié)構(gòu)域圖4 草莓FvARF10、FvARF18所編碼的氨基酸同源性比對AtARF16,AtARF17. Arabidopsis thaliana (At4g30080 and At1g77850); BnARF10. Boehmeria nivea (AMO02493); CaARF8. Capsicum annuum (PHT71835); CsARF10. Camellia sinensis (AGH32871); FvARF10，F(xiàn)vARF18. Fragaria vesca (mrna16844 and mrna09733); HuARF18. Herrania umbratica (XP_021296004); MnARF18. Morus notabilis (XP_010107532); PpARF18. Prunus persica (XP_020414283); PtARF10. Populus trichocarpa (XP_002313508); SlARF10，SlARF16，SlARF17. Solanum lycopersicum (NP_001234796，HM195247.1 and HQ456923); TcARF19. Theobroma cacao (EOY07838)Single black line was B3 DNA binding domain and double black line was auxin response factor conserved domainFig.4 Sequence alignment of the deduced amino acid of FvARF10 and FvARF18

基因名稱Gene name葉綠體運輸肽Chloroplast transit peptide線粒體運輸肽Mitochondrial targeting peptide分泌通道蛋白Secretory pathway signal peptide其他OtherFvARF100.1030.1850.0540.705FvARF180.0720.1040.1270.912

表3 FvARF10、FvARF18啟動子序列中與組織特異性或激素及脅迫誘導相關(guān)的cis元件

與擬南芥ARF家族中的AtARF10、AtARF16基因進化關(guān)系較近，位于同一大類分支中(圖3)。

2.3 FvARF10和FvARF18亞細胞定位預測

對FvARF10、FvARF18蛋白進行亞細胞定位預測分析，數(shù)值結(jié)果如表2所示，數(shù)值越大可信度越高。因此，預測FvARF10、FvARF18蛋白均定位于‘其他’即細胞核或細胞質(zhì)中，具體定位情況仍需實驗進行驗證確定。

2.4 FvARF10和FvARF18基因的啟動子結(jié)構(gòu)分析

FvARF10、FvARF18啟動子序列分析表明，F(xiàn)vARF10、FvARF18除具有調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件，如TATA 框、CAAT 框等，還具有多種逆境響應功能元件，如激素(生長素、ABA、赤霉素)誘導響應元件、光響應元件、防御與脅迫響應元件及調(diào)節(jié)生物節(jié)律等相關(guān)作用元件(表3)。

2.5 FvARF10、FvARF18基因的組織表達分析

以草莓Fv18S為內(nèi)參基因，提取森林草莓不同組織部位的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，對FvARF10、FvARF18基因進行實時定量PCR 擴增。結(jié)果表明，F(xiàn)vARF10、FvARF18在森林草莓的莖、葉片、花、根和果實中均有表達，但是表達量存在明顯差異。如圖5所示，以目的基因在根中表達量為對照，F(xiàn)vARF18在森林草莓的莖中相對表達量最高(圖5)，約為根中的4倍；而FvARF10在果實中表達較高，特別是半熟果(1/2RF)中表達最強(圖5)，約為根中表達量的14倍。以上結(jié)果說明FvARF10、FvARF18可能在森林草莓的不同組織及不同的發(fā)育階段起不同的作用。

2.6 FvARF10、FvARF18基因?qū)AA處理的應答分析

外源激素IAA處理森林草莓植株后，于處理后0、1、6和12 h取材。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，F(xiàn)vARF10與FvARF18均在IAA處理后受到強烈誘導呈先上調(diào)而后恢復正常水平的表達趨勢，并在IAA處理1 h后達到頂峰(圖6)。

3 討 論

中國是世界草莓屬植物種類分布最多的國家,同時也是世界上草莓栽培面積最大、產(chǎn)量最多的國家。草莓的果實是由花托膨大而來，植物學上稱為假果，栽培學上又稱之為漿果。生長素是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要激素之一，對草莓生長發(fā)育有重要的調(diào)控作用，生長激素分泌過多則引起草莓花芽分化異常，導致花器官細胞分裂失調(diào)形成畸形果，或花芽分化時兩朵花或兩朵以上花一同分化，最終形成雞冠果或雙身果等[35-36]。所以，培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)的草莓果實及培育優(yōu)良的草莓品質(zhì)一直是國內(nèi)外草莓種植者和育種工作者追求的目標。因此了解生長素對草莓果實發(fā)育的調(diào)控機理對于優(yōu)良草莓品種的培養(yǎng)及生產(chǎn)實踐具有重要的指導意義。

圖5 森林草莓不同組織中FvARF10和FvARF18相對表達Fig.5 Relative expression of FvARF10 and FvARF18 in different tissues of Fragaria vesca

*和**表示同期處理與對照間差異分別達到0.05和0.01顯著性水平圖6 IAA處理下FvARF10(A)和FvARF18(B)相對表達* and ** indicate significant difference between control and treatment within the same stage at 0.01 and 0.05, respectivelyFig.6 Relative expression of FvARF10(A) and FvARF18 (B) genes under IAA treatment

在生長素信號轉(zhuǎn)導過程中，ARFs家族基因是植物體內(nèi)調(diào)控生長素初級響應基因的調(diào)控因子。如前所述，ARFs對于植物的發(fā)育過程中有重要的調(diào)控作用，如植物胚的形成、葉片的衰老、花器官的脫落和花瓣的生長、果實的坐果和發(fā)育[26-30]。然而, 關(guān)于ARFs家族基因在草莓果實發(fā)育過程中的功能尚無相關(guān)報道。

本研究克隆得到森林草莓ARF家族2個基因，根據(jù)其與其他物種的同源性將其命名為FvARF10、FvARF18。序列分析表明，F(xiàn)vARF10、FvARF18具有ARF家族基因典型的B3 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生長素響應因子特征結(jié)構(gòu)域，表明其屬于草莓中ARFs家族成員。進化樹分析表明，F(xiàn)vARF10、FvARF18屬于不同的分支，其中，F(xiàn)vARF18與桑樹MnARF18聚集在一個分支上，而FvARF10與苧麻BnARF10進化關(guān)系較密切；啟動子分析表明，F(xiàn)vARF10、FvARF18基因的啟動子區(qū)域存在有多種激素響應、脅迫響應、組織形態(tài)建成相關(guān)以及與植物的生理節(jié)律相關(guān)的作用元件，并且發(fā)現(xiàn)FvARF10、FvARF18 啟動子均存在生長素響應元件。組織特異性表達分析顯示，F(xiàn)vARF10、FvARF18基因在草莓的莖、葉片、花、根和果實中均有表達，但是表達量存在明顯差異。這預示著草莓FvARF10、FvARF18基因在草莓生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮著不同的調(diào)控功能。外源激素IAA處理草莓植株后，F(xiàn)vARF10、FvARF18均在IAA處理后受到強烈誘導呈先上調(diào)而后恢復正常水平的表達趨勢，并在IAA處理1 h后達到頂峰，表明FvARF10、FvARF18可能在響應生長素應答過程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

與擬南芥ARF家族基因的進化關(guān)系比較表明，F(xiàn)vARF10與AtARF10關(guān)系較近，而FvARF18則與AtARF16進化關(guān)系較近，ARF 家族基因具有保守的功能結(jié)構(gòu)域和顯著的序列特征。同一物種中的ARF 成員之間和不同物種之間的ARF 基因具有一定的同源性。在擬南芥中，AtARF10與AtARF16存在一定的功能冗余性，同時參與了擬南芥根冠細胞的分化，IAA處理后，ARF16表達水平提高3倍[37-38]。生長素被認為是調(diào)控子房發(fā)育成果實的最主要激素[39], 番茄ARF10對葉的形態(tài)建成和果實早期發(fā)育起著重要作用[40]，大豆GmARF10參與了葉片的衰老過程[41]。本研究中，IAA誘導草莓FvARF10和FvARF18的上調(diào)表達并呈現(xiàn)類似的表達趨勢，且啟動子元件在種類及數(shù)量上具有一定的相似性，因此，F(xiàn)vARF10和FvARF18在功能上是否具有一定的冗余性？FvARF10在果實中的表達量較高，是否在調(diào)控草莓果實發(fā)育過程中行使主要功能？仍有待進一步研究。下一步的工作中，將驗證草莓FvARF10、FvARF18基因DNA 結(jié)合域、蛋白互作結(jié)構(gòu)域及核定位功能，并通過轉(zhuǎn)基因直接驗證FvARF10和FvARF18調(diào)控草莓果實發(fā)育的相關(guān)功能。從分子水平上揭示生長素調(diào)控草莓果實發(fā)育的機理，為將來草莓優(yōu)良品種的培育提供理論基礎(chǔ)。