劉長命，張 顯，王永琦

(1 商洛學(xué)院，陜西商洛 726000；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊陵 712100)

在植物生長發(fā)育過程中，鹽脅迫已成為非生物脅迫中最為嚴(yán)重的不利因素之一，許多育種工作者都把提高作物的耐鹽性作為重要的育種目標(biāo)[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球有約10%的陸地面積被鹽漬化，中國的鹽漬土面積也已接近1×108hm2，且日趨嚴(yán)重。因此，深入開展植物耐鹽性機理研究，對培育耐鹽植物，改善生態(tài)環(huán)境具有非常重要的意義[2]。

多胺主要指腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)，是所有活體細胞含有的一種低分子脂肪胺類。因其具有的多聚陽離子特性，使它能與一些帶負電荷的大分子如DNA和RNA、蛋白質(zhì)、磷脂等相互作用，進而影響他們的活性和穩(wěn)定性[3]。多胺代謝途徑被研究者作為植物潛在抗性研究的目標(biāo)，多胺合成相關(guān)基因與植物對環(huán)境脅迫的抗性關(guān)系也越來越受到關(guān)注，如在冷害[4]、鹽脅迫[5]、病原菌侵染[6]時植物內(nèi)源多胺的合成與代謝都發(fā)生了改變。并且相對于敏感品種，抗性品種在外界環(huán)境脅迫下通常能合成更多的多胺類物質(zhì)來響應(yīng)脅迫[7-9]。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)是Spd和Spm合成過程中的一個關(guān)鍵酶。研究表明，SAMDC基因涉及到眾多植物對非生物脅迫和生物脅迫的抗性反應(yīng)過程[10-11]。Walters等[12]通過對大麥?zhǔn)┯猛庠窜岳蛩峒柞?，改變了大麥體內(nèi)的多胺代謝水平，并誘導(dǎo)了其對白粉病的系統(tǒng)防衛(wèi)反應(yīng)。Wi等[13]研究表明，轉(zhuǎn)康乃馨SAMDC基因的煙草植株內(nèi)源多胺含量出現(xiàn)明顯上升，同時增強了轉(zhuǎn)基因煙草對外界脅迫的廣譜抗性。

在作者前期的研究中[14]，已從抗病甜瓜品種‘云甜930’中克隆獲得了SAMDC基因，命名為CmSAMDC(GenBank登錄號為KF151861)。CmSAMDC蛋白有2個高度保守的結(jié)構(gòu)域，與擬南芥(CAA69073.1)相似性達97%。為了進一步研究該蛋白的功能，本研究構(gòu)建了35S∷CmSAMDC植物過表達載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，并對過表達植株的耐鹽性進行分析，以期為利用該基因進行植物耐鹽性改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料及菌株

供試擬南芥為哥倫比亞野生型，擬南芥種子經(jīng)消毒和清洗干凈后，用0.05%瓊脂均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，封口，4 ℃暗中春化2 d后置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度22℃/20 ℃ (晝/夜)、光照16 h/8 h(光/暗)，約2周后移至8 cm盆內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。實驗中用到的大腸桿菌菌株DH5α，農(nóng)桿菌菌株GV3101，植物表達載體pCAMBIA1304均由本實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1過表達載體的構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化將克隆獲得CmSAMDC基因的ORF構(gòu)建到過表達載體pCAMBIA1304上，兩端引入SacI和SpeI酶切位點，引物序列見表1。對CmSAMDC基因編碼序列和載體p1304分別雙酶切后連接過夜，構(gòu)建p1304-CmSAMDC過表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后參考Clough等[15]的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。T0代種子用50 mg/L濃度潮霉素(Hyg)進行抗性篩選，之后降至30 mg/L濃度篩選至T3代。

表1 引物序列

1.2.2轉(zhuǎn)基因植株SAMDC基因表達分析對6周齡的T3代轉(zhuǎn)基因株系TA1和TB1的CmSAMDC基因和擬南芥的SAMDC基因家族進行半定量和實時定量分析，引物序列見表1。半定量反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。實時定量反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20s，40個循環(huán)，以擬南芥Actin2基因作為內(nèi)參，3次重復(fù)。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性鑒定將T3代轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥的種子播于含不同濃度NaCl(0、100、150、200、300 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上觀察發(fā)芽情況。將MS培養(yǎng)基上生長15 d的幼苗一部分移至上述濃度NaCl培養(yǎng)基上觀察其對鹽脅迫的抗性，一部分移栽入盆培養(yǎng)至4周齡再分別澆灌200 mmol/L或400 mmol/L NaCl溶液，每穴澆灌15 mL，每2 d 1次，于鹽脅迫后第12天參照Sunkar等[16]的方法測定脂質(zhì)過氧化水平(MDA)。

1.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量測定精確稱取0.05 g新鮮葉片，去主脈后剪碎，加入80%丙酮5 mL避光浸提24 h，測定663、645和470 nm吸光值，計算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmSAMDC基因序列分析

作者前期克隆獲得了CmSAMDC基因的ORF序列，全長1 095 bp(圖1)。序列分析表明編碼364個氨基酸，分子量40 kD，等電點4.61，含酶原剪切位點和PEST 2個保守結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與擬南芥(CAA69073.1)相似性達97%(圖2)。

2.2 CmSAMDC基因植物過表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及抗性篩選

為了驗證CmSAMDC基因在植物體內(nèi)的功能，根據(jù)p1304載體和基因的序列特征，構(gòu)建了植物

過表達載體，命名為35S∷CmSAMDC，其T-DNA區(qū)示意圖如圖3，A所示。將構(gòu)建好的過表達載體以農(nóng)桿菌浸染的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，潮霉素(Hyg)抗性篩選發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥種子在萌發(fā)后不久(約7 d)逐漸死亡，而轉(zhuǎn)基因種子可以正常生長(圖3，B1)。通過目的基因的PCR檢測，獲得了4個轉(zhuǎn)基因株系(圖3，B2)，其中TA1和TA2株系基因表達量最高，生長正常(圖3，B3)。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)特征與光合色素含量

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，T3轉(zhuǎn)基因株系TA1和TB1株高在播種后4周明顯高于野生型(WT)擬南芥，平均株高達28 cm，而WT平均株高18 cm，且轉(zhuǎn)基因植株抽薹更多(圖4，A)，葉片顏色也更深(圖4，B)。對葉片光合色素含量測定表明(圖4，C)，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)、總?cè)~綠素(Ct)及類胡蘿卜素(Cx.c)含量均顯著高于野生型植株。

2.4 CmSAMDC基因的表達分析

通過對轉(zhuǎn)基因植株的篩選，選取TA1和TB1株系進行CmSAMDC基因定量和半定量表達分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甜瓜CmSAMDC基因在TA1和TB1中成功表達(圖5，A、B)。

M. DL2000; 1.CmSAMDC擴增產(chǎn)物圖1 甜瓜CmSAMDC基因PCR擴增產(chǎn)物M. DL2000; 1. PCR products of CmSAMDC geneFig.1 PCR products of CmSAMDC gene in melon

圖2 部分植物SAMDC氨基酸進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of the SAMDC amino acid sequences of some species

A. 植物超表達載體T-DNA區(qū)示意圖; B1為WT和T3植株在含潮霉素培養(yǎng)基上生長7 d, B2和B3分別為T3植株播種后20 d和45 d;WT. 野生型擬南芥; T3. 轉(zhuǎn)CmSAMDC基因植株圖3 過表達CmSAMDC基因擬南芥的生長情況A. Schematic representation of T-DNA regions of 35S∷CmSAMDC; B1 indicates the growth of WT and T3 Arabidopsis lines on MS medium with hygromycin after seven days, B2 and B3 indicate the growth of T3 Arabidopsis lines after 20 days and 45 days respectively; WT. Wild type of Arabidopsis; T3. The transgenic Arabidopsis with CmSAMDC geneFig.3 Growth of transgenic Arabidopsis lines over-expressing CmSAMDC gene

A、B.野生型(WT)擬南芥和轉(zhuǎn)CmSAMDC基因植株(TA1、TB1)的株高和葉色; C. 擬南芥各株系的光合色素含量比較;Ca.葉綠素a; Cb.葉綠素b; Ct.總?cè)~綠素; Cx.c.類胡蘿卜素; **表示差異極顯著(P<0.01),下同圖4 擬南芥野生型(WT)和轉(zhuǎn)CmSAMDC基因(T3)植株的表型比較A, B. The height and leaf color in wild type and transgenic Arabidopsis lines; C. The comparison of photosynthetic pigment contents in different Arabidopsis lines: Ca. Chlorophyll a; Cb. Chlorophyll b; Ct. Chlorophyll a+b; Cx.c. Carotenoids; ** indicate significant differences among samples at 0.01 level. The same as belowFig.4 The comparison of phenotypic characteristics between wild type and transgenic Arabidopsis

對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的SAMDC基因家族表達分析發(fā)現(xiàn)，除AbSAMDC2 外，其他家族成員AbSAMDC、AbSAMDC3、AbSAMDC4在不同植株中均有不同程度表達(圖6)。這一結(jié)果表明，異源CmSAMDC的表達沒有明顯導(dǎo)致擬南芥中該同源基因的抑制表達。

2.5 轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥的耐鹽性分析

對轉(zhuǎn)基因T3代株系TA1、TB1和WT植株在不同濃度NaCl脅迫下的種子發(fā)芽率進行觀察，結(jié)果顯示，在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上，WT植株和轉(zhuǎn)基因T3植株的生長情況相似(圖7，A)；而在含150 mmol/L鹽培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因T3代的種子發(fā)芽較WT種子遲約1 d (圖7，B)，但隨后生長勢卻強于野生型植株(圖7，C)。同時，對根系觀察也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因T3植株在100、150、200 mmol/L濃度鹽脅迫下側(cè)根較WT植株更為發(fā)達(圖7，D)。

將MS培養(yǎng)基上生長15 d的幼苗移栽至穴盤中，緩苗3 d后，隔日澆1次NaCl溶液。在200 mmol/L NaCl處理8 d后，轉(zhuǎn)基因T3代植株TA1和TB1未表現(xiàn)鹽害癥狀或者癥狀較輕，但WT植株葉片出現(xiàn)輕微黃化；在400 mmol/L NaCl處理8 d后，轉(zhuǎn)基因植株生長受阻，但仍能繼續(xù)維持生長，而WT植株生長嚴(yán)重受阻并黃化；澆水對照組WT和T3代植株的長勢基本一致(CK)(圖8，A)。在200 mmol/L NaCl脅迫16 d后，WT植株株型明顯小于TA1和TB1；400 mmol/L NaCl脅迫16 d后，TA1和TB1生長受阻較重，而WT植株已經(jīng)死亡(圖8，B)。對鹽脅迫12 d的植株葉片測定脂質(zhì)過氧化程度(MDA)顯示(圖8，C)，WT植株在200和400 mmol/L NaCl脅迫下，MDA 水平分別上升了92.%和376%，TA1、TB1植株的MDA上升程度約為WT植株的一半，各自上升了49.9%、196%和27.5%、149.5%。

圖6 擬南芥SAMDC基因在不同植株中的表達Fig.6 The SAMDC gene expressed in different A. thaliana lines

TA1和TB1為轉(zhuǎn)基因擬南芥; WT1為野生型擬南芥; 下同圖5 CmSAMDC基因在擬南芥中表達的半定量(A)和實時定量(B)分析TA1 and TB1 indicate transgenic Arabidopsis lines; WT1 indicates wild type Arabidopsis line; the same as belowFig.5 Semi-quantitative PCR(A) and Real-time qRT-PCR(B) analyses of the CmSAMDC gene expressed in Arabidopsis lines

A. 播種后3 d; B. 播種后7 d; C.移植后7 d; D. 移植后15 d 圖7 不同濃度鹽脅迫對WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響A. 3 days after sowing; B. 7 days after sowing; C. 7 days after transplantation; D. 15 day after transplantationFig.7 The influence of different concentrations of salt on WT and transgenic T3 plants

A. 鹽處理后8 d; B.鹽處理后16 d; C. 鹽處理后12 d圖8 不同鹽濃度灌根對WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響A. 8 days after salt treatment; B. 16 days after salt treatment; C. 12 days after salt treatmentFig.8 The influence of different salt concentrations on WT and transgenic T3 plants by root irrigation

3 討 論

SAMDC是Spd和Spm合成的關(guān)鍵基因，它催化Put轉(zhuǎn)化為Spd和Spm。目前，一些植物的SAMDC基因如甜瓜[17]、甘蔗[18]、番茄[19]等已被鑒定，且該基因在不同植物中序列相似性較高，保守性強，推測與其在植物生長發(fā)育和響應(yīng)脅迫中的重要作用相關(guān)。有研究表明[7,20]，SAMDC基因涉及到多種非生物脅迫的抗性反應(yīng)中，如高溫、冷害及鹽脅迫等，且抗性品種較敏感品種的表達水平更高。研究還表明[13,19]，一些轉(zhuǎn)SAMDC基因的植物表現(xiàn)出了對外界脅迫的廣譜抗性。在本研究中，轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株較野生型植株表現(xiàn)出更強的耐鹽性，150和200 mmol/L促進了轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根的生長，并且轉(zhuǎn)基因植株幼苗在含150 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上生長較野生型更快。對4周齡幼苗澆灌200和400 mmol/L NaCl溶液也表現(xiàn)出了轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性更強的特征。但是，種子萌發(fā)情況卻不盡相同，表現(xiàn)為150 mmol/L鹽溶液延遲了轉(zhuǎn)基因植株種子的萌發(fā)時間，子葉長出時間較野生型植株晚約1 d，推測轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)時間的延遲可能與其種子千粒重減小，營養(yǎng)物質(zhì)儲存少有關(guān)。

在植物受到脅迫后，多胺對促進細胞分裂、誘導(dǎo)細胞凋亡、次生代謝調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等起著重要的作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株表現(xiàn)出了對鹽脅迫的抗性，但轉(zhuǎn)基因株系的激素含量變化與其異源CmSAMDC基因的表達量并無一致對應(yīng)關(guān)系，推測多胺通過某種調(diào)控機制或者與某些激素共同參與了抗性反應(yīng)過程。不過，從作者前期的研究來看[14,22-23]，在對不同抗性甜瓜接種白粉病菌后，抗病甜瓜品種的Put、Spd和Spm含量均較感病品種要高，抗氧化酶活性也更高，本研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脂質(zhì)過氧化程度(MDA)較野生型也更低。說明甜瓜抗病品種和轉(zhuǎn)CmSAMDC基因擬南芥植株在受到外界脅迫時，能通過協(xié)調(diào)各種活性氧清除系統(tǒng)以清除過多的活性氧積累，減少由其帶來的傷害，更好地維持植物活性氧水平的代謝平衡[24-25]，而這一調(diào)控過程涉及了多胺類物質(zhì)的參與。在下一步的研究中，將進一步鑒定由多胺直接或間接調(diào)控，并具有防御逆境脅迫作用的潛在基因和抗性物質(zhì)。