, , , ,2

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 貴陽(yáng) 550006)

喹啉酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase,QPT)是煙草煙堿(nicotine)合成的限速酶[1-2]。QPT在催化煙堿重要結(jié)構(gòu)1, 2-二氫吡啶(1,2-dihydropyridine)環(huán)形成的過(guò)程中,也催化其前體物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的產(chǎn)生[3],而后者又可作為多種酶的輔酶調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝、呼吸鏈電子傳遞、蛋白翻譯后修飾、Ca2+信號(hào)通路和基因沉默等生理過(guò)程, 并最終影響生物體的生長(zhǎng)發(fā)育[4-5]。研究表明,QPT基因沉默不僅可引起轉(zhuǎn)基因煙草株高的明顯矮化，還會(huì)導(dǎo)致部分轉(zhuǎn)基因植株的葉片數(shù)、開(kāi)花數(shù)顯著減少及花粉發(fā)育畸形或不育等現(xiàn)象[6]。植物體中除NAD等初生代謝物會(huì)直接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育外, 次生代謝物(如植物激素)也能調(diào)節(jié)植物的發(fā)育和生長(zhǎng)[7]。研究表明, 植物體不僅能通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)ABA(abscisic acid)與GA(gibberellin)的平衡促進(jìn)或抑制種子萌發(fā)[8],也可通過(guò)調(diào)節(jié)6-BA(6-benzylaminopurine)和IAA(indoleacetic acid)的比例來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)及品質(zhì)[9]。本研究以QPT干涉表達(dá)的T1代轉(zhuǎn)基因煙草種子及煙苗為材料, 分析ABA和6-BA處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)及煙苗生長(zhǎng)的影響, 同時(shí)分析不同激素引起的轉(zhuǎn)基因植株理化性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律, 為探討QPT基因與ABA或6-BA協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)及煙苗生長(zhǎng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

普通煙草(NicotianatobacumL.)品種“Xanthi”、T1代超量表達(dá)和干涉表達(dá)QPT基因煙草種子由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存并提供。6-BA和ABA均購(gòu)于Sigama Aldrich公司; DNA Marker 購(gòu)于Takara 生物工程公司;植物DNA提取試劑盒購(gòu)于Tiangen Biotech(Beijing)Co.,Ltd.,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)購(gòu)于Suzhou Comin Biotechnology Co.,Ltd.;無(wú)水乙醇(分析純)購(gòu)于Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co.,Ltd.。

1.2 方 法

1.2.1 激素對(duì)煙種進(jìn)行處理

參照秦利軍等[10]的方法略有改動(dòng)，分別對(duì)轉(zhuǎn)基因及野生型煙草種子的萌發(fā)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。挑選飽滿、大小一致的T1代QPT超量表達(dá)與干涉表達(dá)煙草種子和同批繁殖的野生型煙草的種子依次經(jīng)70%酒精和2.5% NaClO表面消毒后用無(wú)菌水清洗3～5次, 分別置于墊有2層滅菌濾紙且分別含有5 mg/L 6-BA和2 mg/L ABA的9 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)處理(約5 mL激素溶液, 以無(wú)菌水作為對(duì)照), 每皿播種50粒種子, 每處理設(shè)置5 個(gè)重復(fù)。在25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照16 h/黑暗8 h)，種子萌發(fā)以露白計(jì)，記錄19 d內(nèi)煙草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)。測(cè)定指標(biāo)按下列公司進(jìn)行計(jì)算：

發(fā)芽率(%)=第19天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=第10天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)。

式中，Gt為逐日發(fā)芽數(shù),Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定

剪取T2代煙苗的葉片少量進(jìn)行GUS化學(xué)組織染色, 提取GUS染色陽(yáng)性植株葉片總DNA用于PCR鑒定。PCR擴(kuò)增體系(20μL):正反向引物(20μmol/L)各加 1μL,Premix rTaq10μL,DNA 模板1μL,dd H2O 7μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸7 min,4 ℃保存。特異性檢測(cè)引物對(duì)FQPT/RQPT序列分別為:F-QPT:5’-CGCACAATCC-CACTATCCTT-3’;R-QPT:5’-TTAGAGCTTTGCCGACACCT-3’。

1.2.3 激素對(duì)煙苗進(jìn)行處理及記錄

將清水萌發(fā)的轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草種子移栽至育苗盤(pán),待種子長(zhǎng)至大十字期時(shí)栽種到花盆中,隔3～5 d澆1次水。煙苗生長(zhǎng)到拔節(jié)期時(shí)分別用6-BA(40 mg/L)和ABA(20 mg/L)進(jìn)行噴施處理, 每個(gè)處理重復(fù)3次, 以超量表達(dá)QPT煙草和野生型煙草為對(duì)照處理。同時(shí), 每實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置3個(gè)以清水噴施的空白對(duì)照。種植期間隔一定距離, 定期進(jìn)行灌根澆水以保證煙株生長(zhǎng)對(duì)水分的需求。激素噴施處理周期為21 d,每周噴3次激素，每株定量噴施10 mL, 并在實(shí)驗(yàn)起始的7，14，21 d做煙草形態(tài)指標(biāo)觀察和記錄。

參照國(guó)家煙草專賣局2010年發(fā)布的煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法(Investigating and measuring methods of agronomical character of tobacco)YC/T 142-2010標(biāo)準(zhǔn)對(duì)激素處理煙草植株的農(nóng)藝性狀，包括株高、真葉數(shù)、莖圍、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬等指標(biāo)進(jìn)行觀察、記錄,每個(gè)測(cè)定指標(biāo)測(cè)定3次。

1.2.4 激素處理對(duì)煙草理化性質(zhì)影響

選取拔節(jié)期、生長(zhǎng)一致的煙草植株進(jìn)行全株噴施ABA(20 mg/L)和6-BA(40 mg/L)激素溶液, 分別取噴施處理前、噴施后第1、3天煙草植株自上向下第4片真葉進(jìn)行SOD酶活測(cè)定。酶活測(cè)定參照Suzhou Comin Biotechnology Co.,Ltd.操作說(shuō)明以酶標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定, 每組以混樣的方式取樣(即以3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品做混池),每組重復(fù)測(cè)定3次,以野生型和超量表達(dá)QPT煙草為對(duì)照組,清水噴施處理為空白組。

葉綠素含量按鄒琦[11]方法測(cè)定, 將取好的葉片放在研缽中, 加入少許石英砂與碳酸鈣粉, 在加入3 mL 96%乙醇磨成勻漿合并提取液并定容至25 mL棕色容量瓶, 避光保存, 在波長(zhǎng)665 nm、649 nm、470 nm測(cè)定其光密度, 分別按下式進(jìn)行葉綠素a(chlorophyll a)、葉綠素b(chlorophyll b)、類胡蘿卜素(carotenoid)和葉綠素色素含量計(jì)算：

Ca=13.95 D665-6.88 D649；

Cb=24.96 D649-7.32 D665；

Cx=(1 000 D470-2.05 Ca-114.8 Cb)/245；

葉綠素色素含量=提取液體積×色素濃度(C)×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重(mg/g)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

以Microsoft Excel 2011軟件對(duì)上述測(cè)定的所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差計(jì)算、作圖, 以SPSS 17.0軟件對(duì)各個(gè)測(cè)定值得顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙種萌發(fā)的影響

從表1結(jié)果可知,相比較野生型和超量表達(dá)煙草,以5 mg/L 6-BA處理均能顯著提高QPT干涉植株種子的GP、GE和GI。萌發(fā)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(以種子露白計(jì))表明,5 mg/L 6-BA處理第9天時(shí)干涉表達(dá)QPT煙草種子基本全部發(fā)芽,發(fā)芽率高達(dá)91.33%,而超量表達(dá)QPT和野生型種子到第11天時(shí)才完全發(fā)芽, 發(fā)芽率分別為58.67%和52.67%,且兩者差異不顯著。6-BA對(duì)QPTi煙株種子萌發(fā)促進(jìn)作用相較WT和QPT植株分別提高55.67%和73.40%。與野生型相比,6-BA處理也能促進(jìn)QPT煙草種子的萌發(fā), 但兩者差異不顯著;以2 mg/L ABA處理能明顯抑制WT和QPT煙草種子的萌發(fā),抑制率分別可達(dá)99.33%和94%,相比之下ABA對(duì)QPTi種子萌發(fā)抑制率為63.4%,說(shuō)明QPT基因干涉后轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出對(duì)ABA的低敏感性,種子萌發(fā)相較野生型和超量表達(dá)植株影響較小;QPT煙株和WT煙株種子分別在ABA處理后的第14天和第17天才開(kāi)始萌發(fā),而QPTi煙株種子在激素處理后的第10天就開(kāi)始萌發(fā)。

表1 種子發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定

激素種子類型發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽指數(shù)QPT58.67±8.8160±8.7*30.51±3.58*6-BAQPTi91.33±3.53**91.33±3.5**50.98±3.33**WT52.67±5.3352.67±5.325.46±1.26QPT6.00±1.161.33±0.70.51±0.12ABAQPTi36.67±10.41**24.67±7**6.50±2.09*WT0.67±0.670.00±0.000.04±0.036

注：QPT為超量表達(dá)煙草植株;QPTi為干涉表達(dá)煙草;WT為野生型煙草。以各組中野生型種子萌發(fā)指標(biāo)為對(duì)照，N=50,“*”代表p<0.05,“**”代表p<0.01。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與鑒定

以T1代種子萌發(fā)的煙草幼苗為材料進(jìn)行GUS染色及PCR驗(yàn)證,以確定獲得QPT超量和QPT干涉表達(dá)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因煙草植株。剪取萌發(fā)至3～5葉期中心葉片進(jìn)行GUS染色, 超量表達(dá)和干涉表達(dá)煙草幼葉均染成藍(lán)色, 野生型未出現(xiàn)變化(圖1 A);進(jìn)一步對(duì)2種轉(zhuǎn)基因煙草GUS染色陽(yáng)性的植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別從超量表達(dá)煙草和干涉表達(dá)煙草中擴(kuò)增到大小為750 bp和500 bp的特異性條帶(圖1 B),說(shuō)明QPT超量表達(dá)片段與QPT干涉片段已經(jīng)完全整合到煙草基因組中并能進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳。生長(zhǎng)后期, 野生型植株生長(zhǎng)狀態(tài)顯著優(yōu)于兩種轉(zhuǎn)基因植株(圖1 C)。

2.3 激素處理對(duì)煙草形態(tài)指標(biāo)的影響

植物激素通過(guò)調(diào)節(jié)其在植株內(nèi)的和表達(dá)水從而影響植物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育,研究分別以20 mg/L ABA和40 mg/L 6-BA對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行噴施處理以研究不同激素對(duì)QPT干涉煙草植株形態(tài)的影響。研究結(jié)果表明,以清水處理的超量表達(dá)和干涉表達(dá)QPT煙草在第7、14天和第21天的葉片數(shù)、株高、葉寬、葉長(zhǎng)和莖圍等指標(biāo)都顯著高于野生型植株(表1,表2,表3),但以40 mg/L 6-BA對(duì)煙草植株進(jìn)行處理時(shí), 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因(QPT和QPTi)和野生型植株在各測(cè)定各時(shí)期(處理第7、14天和第21天)的形態(tài)指標(biāo)均受到一定程度抑制, 其中以第21天時(shí)6-BA對(duì)野生型煙草的葉片數(shù)、株高、葉寬和葉長(zhǎng)指標(biāo)抑制程度最高,QPT煙草次之,QPTi煙草最低; 與QPTi煙株相比較,以40 mg/L 6-BA處理第21天時(shí)野生型煙草植株下同。

注：QPT為超量表達(dá)煙草;QPTi為干涉表達(dá)煙草;WT為野生型煙草；M為5 000 bp DNA Marker Ladder；P 1、P 2為陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照;Q 1～Q 3為超量表達(dá)煙草植株;q 1～q 3為干涉表達(dá)煙草植株。圖1 轉(zhuǎn)基因植株鑒定及生長(zhǎng)形態(tài)觀察

表2 激素處理第7天煙草農(nóng)藝性狀測(cè)定

處理基因型農(nóng)藝性狀葉片數(shù)株高(cm)葉寬(cm)葉長(zhǎng)(cm)莖圍(cm)QPT10.33±0.58*11.27±2.46*9.92±1.58*16.52±2.55*1.51±0.08*水QPTi10.67±0.58*13.08±0.68*8.24±1.7014.38±2.341.43±0.07WT9.33±1.159.77±2.467.97±0.9314.66±2.551.40±0.10QPT9.67±0.5812.19±0.25*9.03±0.42*15.17±1.291.67±0.03**6-BAQPTi10.33±1.52*14.06±2.65**10.15±0.61*17.28±0.50*1.67±0.05**WT8.67±0.57*9.34±0.258.36±0.6414.51±0.531.67±0.04**QPT9.33±0.578.99±2.018.53±1.0515.64±2.05*1.39±0.14ABAQPTi11.00±1.00*11.88±1.99*7.39±0.32*13.03±0.74*1.41±0.07WT8.67±0.57*8.37±0.38*6.77±0.26*12.74±0.35*1.35±0.15*

注：n=3,“*”為差異顯著(p<0.05)，“**”為差異極顯著(p<0.01),顯著性均與清水對(duì)照相比較。

表3 激素處理第14天煙草農(nóng)藝性狀測(cè)定

處理基因型農(nóng)藝性狀葉片數(shù)株高(cm)葉寬(cm)葉長(zhǎng)(cm)莖圍(cm)QPT13.33±0.58*22.64±3.58*12.10±0.26*19.92±0.21.84±0.07*水QPTi13.33±0.57*20.91±2.5110.37±1.8517.66±2.38*1.67±0.18WT12.33±1.1520.35±3.7210.57±1.1719.82±2.871.69±0.08QPT13.00±1.00*19.29±3.2410.03±0.6016.81±1.29*1.93±0.156-BAQPTi12.00±1.0021.30±3.2910.78±0.2917.62±0.45*1.84±0.03*WT11.33±0.58*16.74±1.17*9.42±0.55*15.3±0.94**1.93±0.08QPT11.67±0.58*18.25±4.42*9.87±1.26*17.31±2.20*1.71±0.08ABAQPTi13.33±1.52*19.02±1.549.47±0.15*16.17±0.57*1.53±0.32*WT9.67±0.58**14.49±0.96*7.57±0.47**14.19±0.6**1.43±0.11**

葉片數(shù)、株高、葉寬和葉長(zhǎng)指標(biāo)的抑制率分別為 81.6%、83.9%、86.7%和87.6%。另外,20 mg/L ABA處理也可抑制3種煙草植株的株高、葉片數(shù)和莖圍等指標(biāo)增加,其中以對(duì)野生型煙草抑制最為顯著。研究結(jié)果顯示,盡管20 mg/L ABA對(duì)煙株的生長(zhǎng)也具有抑制作用,但其抑制效果相較40 mg/L 6-BA弱。相較QPTi植株,在ABA處理后第7、14天和第21天時(shí)野生型植株的葉片數(shù)和株高指標(biāo)的抑制率分別為78.8%、72.54%、71.1%和70.5%、76.2%、84.5%,表明隨著處理天數(shù)的推移對(duì)這2個(gè)差異最為顯著的指標(biāo)抑制也減弱。

2.4 激素處理對(duì)煙草理化指標(biāo)的影響

2.4.1 激素處理對(duì)煙草SOD酶活性的影響

SOD酶活測(cè)定結(jié)果表明,2種激素(20 mg/L ABA和40 mg/L 6-BA)處理前,QPTi植株與WT和QPT植株間酶活均存在顯著差異, 但后兩者間SOD酶活無(wú)顯著差異,推測(cè)QPT基因的干涉能顯著提高干涉植株的氧化保護(hù)酶活性。隨著激素處理的推移,ABA和6-BA處理引起的SOD酶活都出現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì), 但酶活的降幅和增幅在不同株系煙草中有一定差異。激素處理QPT、QPTi、WT植株1 d時(shí),其SOD酶分別下降了32.41%、44.13%和17.83%,而ABA處理的分別下降13.36%、42.78%、10.77%,可知3種煙草株系中以QPTi煙草SOD酶活性對(duì)2種激素的應(yīng)答最為顯著,降幅也最大。但當(dāng)激素處理3 d時(shí),SOD酶活在WT、QPT和QPTi植株中都表現(xiàn)出不同程度的增加,相較處理1 d時(shí)SOD酶活,6-BA處理引起超量表達(dá)、干涉表達(dá)和野生型植株中酶活性分別上升46.03%、46.18%和32.06%,而ABA處理引起的SOD酶活增加分別為31.80%、29.51%和15.51%。

表4 激素處理第21天煙草農(nóng)藝性狀測(cè)定

處理基因型農(nóng)藝性狀葉片數(shù)株高(cm)葉寬(cm)葉長(zhǎng)(cm)莖圍(cm)QPT16.67±0.58*30.50±3.5912.79±0.70*21.72±0.89*1.99±0.03*水QPTi16.00±0.00*26.69±3.31*11.16±1.9618.78±1.63*1.82±0.13WT14.67±1.5228.68±3.9311.62±1.1220.73±1.981.84±0.09QPT16.33±0.58*24.74±5.02*10.49±0.97*17.29±1.23*2.12±0.15**6-BAQPTi15.33±2.3025.64±3.34*11.24±0.4717.76±0.431.93±0.02*WT13.33±0.58*21.50±1.82*9.75±0.2*15.55±0.60**2.08±0.14**QPT14.00±0.0025.72±4.6*11.57±0.6720.10±1.441.95±0.04*ABAQPTi15.00±1.0022.53±3.02*9.76±0.2*18.53±0.5*1.67±0.06*WT10.67±2.08**19.04±1.06**8.59±1.02**15.57±1.84**1.52±0.09**

注：QPT為超量表達(dá)煙草;QPTi為干涉表達(dá)煙草;WT為野生型煙草。下同。圖2 激素處理對(duì)煙草SOD酶活性的影響

圖3 激素處理對(duì)煙草Ca和Cb含量的影響

2.4.2 激素處理對(duì)煙草葉綠素含量的影響

激素ABA和6-BA處理對(duì)3種煙草株系的葉綠素a(Ca)和葉綠素b(Cb)均有一定程度影響。就以40 mg/L 6-BA處理而言,該激素對(duì)干涉植株Ca含量的抑制程度要高于野生型和超量表達(dá)植株。6-BA噴施處理3種煙草植株,在處理第1天時(shí)QPT、QPTi和WT植株分別下降16.75%、22.7%和15.35%,到第3天時(shí)Ca含量在這3類煙草植株中都有一定程度回升;與6-BA處理結(jié)果相同,ABA處理也可引起QPTi、QPT和WT煙株中Cb含量顯著下降,其中對(duì)QPTi株系Ca含量的影響較其他2個(gè)株系顯著;同時(shí)對(duì)激素處理后煙草中Cb測(cè)定表明,6-BA處理后Cb含量總的也呈下降趨勢(shì),其中以WT降幅最大,達(dá)39.63%,QPT和QPTi分別為24.5%、22.08%。但QPTi植株僅在處理第1天時(shí)下降幅度最大,為25.08%,之后開(kāi)始Cb含量開(kāi)始增加,到處理第3天時(shí)增加了4.03%(與處理第1天時(shí)比較),而QPT和WT中Cb含量持續(xù)下降;短期內(nèi)(1 d)ABA處理對(duì)WT和QPTi植株的Cb含量影響并不大,但對(duì)QPT煙株中的Cb影響較顯著,到第3天時(shí)QPT中Cb含量總降幅為29.09%。

圖4 激素處理對(duì)煙草Cx和Ct含量的影響

進(jìn)一步對(duì)煙草的類胡蘿卜素含量(Cx)和葉綠素總含量測(cè)定結(jié)果表明,20 mg/L ABA和40 mg/L 6-BA處理后煙草的類胡蘿卜素(Cx)合成受到抑制,進(jìn)而引起Cx含量下降,其中以6-BA處理對(duì)Cx含量抑制影響效應(yīng)高于ABA處理。QPT與QPTi植株中Cx含量的降幅相當(dāng)且較大,分別為32.15%和31.97%,而WT植株Cx含量下降較低,僅為20.23%;ABA處理引起的QPTi、WT和QPT煙株Cx含量下降分別18.42%、16.15%和14.90%,相較6-BA處理顯著低,在3 d時(shí)又有一定程度的增加。2種激素引起的植株葉綠素總含量(Ct)總體呈下降趨勢(shì),同樣以6-BA處理的煙苗影響較大,其中QPTi煙株對(duì)6-BA最為敏感，處理后第1天時(shí)降幅即達(dá)到23.01%，第3天時(shí)又下降7.05%,而QPT和WT中Ct含量總體降幅不及QPTi顯著,但兩者下降趨勢(shì)一致。以上研究,一方面高濃度細(xì)胞分裂素(6-BA)對(duì)煙株生長(zhǎng)有一定的抑制作用,另一方面QPT基因干涉后通常會(huì)表現(xiàn)出對(duì)高濃度植物激素具有較敏感的效應(yīng),推測(cè)QPT具有調(diào)節(jié)植物在應(yīng)答高濃度植物激素脅迫生長(zhǎng)的代謝過(guò)程中具有一定的延緩效應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

QPT不僅是催化煙草煙堿合成的限速酶,也是催化生物體眾多酶的輔酶NAD從頭合成的關(guān)鍵酶,對(duì)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[12-13]。另外,植物激素對(duì)植物種子萌發(fā)[14]、生長(zhǎng)發(fā)育[15]以及品質(zhì)[16]也同樣具有顯著的影響。本研究以外源激素對(duì)種子和種苗進(jìn)行處理,分析QPT超量表達(dá)及干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草材料對(duì)激素的應(yīng)答效應(yīng),以探討激素調(diào)控下QPT對(duì)煙草萌發(fā)生長(zhǎng)的調(diào)控作用。一方面,低濃度5 mg/L 6-BA能顯著促進(jìn)QPTi種子的萌發(fā),萌發(fā)指標(biāo)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)與WT、QPT相比呈極顯著,QPTi種子的發(fā)芽率與WT、QPT相比分別增加73.40%、55.67%,6-BA是一種植物細(xì)胞分裂素,具有促進(jìn)植物芽分化、提高種子活力的功能[17]。但而高濃度40 mg/L 6-BA對(duì)QPT、QPTi和WT煙草均產(chǎn)生一定程度的抑制作用,農(nóng)藝性狀如株高、葉寬、葉長(zhǎng)等生長(zhǎng)都受到影響，其中以對(duì)QPT和WT的葉長(zhǎng)指標(biāo)的抑制最顯著,分別為15.59%和33.34%,以上結(jié)果與成丹等[18]研究不同濃度6-BA對(duì)大豆生長(zhǎng)萌發(fā)影響的結(jié)果相似。另一方面,低濃度ABA和高濃度ABA可分別抑制種子萌發(fā)和煙株生長(zhǎng)。當(dāng)以2 mg/L ABA處理的煙草種子時(shí),相比較QPTi植株,WT種子受抑制程度最大為98.2%,QPT種子其次,為82.64%;當(dāng)以20 mg/L ABA處理煙草時(shí),ABA又會(huì)顯著抑制QPTi和WT的株高、葉長(zhǎng)、葉寬、莖圍等形態(tài)指標(biāo)生長(zhǎng),其中以對(duì)WT植株的抑制程度最大,QPTi次之,對(duì)QPT植株抑制程度最小,ABA對(duì)前兩者株高指標(biāo)的抑制率分別為33.59%和21.42%。ABA是一種植物生長(zhǎng)抑制劑,具有調(diào)控葉片衰老、減緩不良環(huán)境脅迫、影響種子萌發(fā)的作用[19]。王熹等[20]報(bào)道了外源植物激素ABA(脫落酸)抑制水稻種子發(fā)芽的實(shí)質(zhì)是延緩種子發(fā)芽,ABA的處理引起種子體內(nèi)代謝過(guò)程緩慢并最終使得種子萌發(fā)率下降,推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中由于統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)天數(shù)的限制導(dǎo)致短期內(nèi)ABA處理的種子萌發(fā)率低。另外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與匡勇等[21]報(bào)道的脫落酸(ABA)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用結(jié)論不同,可能是本研究所選的ABA處理濃度仍較高，導(dǎo)致表現(xiàn)出抑制煙草種子萌發(fā)的效應(yīng)。另外,激素處理前QPTi植株SOD酶顯著高于另外兩種植株,推測(cè)QPTi煙草由于QPT基因干涉導(dǎo)致煙堿含量下降,而后者在抗病、抗蟲(chóng)方面具有顯著的作用,故其遭到蟲(chóng)害及不良環(huán)境的可能性增高,導(dǎo)致QPTi植株處于較高的SOD酶活性。激素處理后所有煙草株系均表現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì),其中對(duì)轉(zhuǎn)QPTi煙草的影響較大，6-BA與ABA處理1 d分別下降44.13%、42.78%,各激素處理后SOD酶活性在第3天后QPT、WT、QPTi的SOD酶活性能呈現(xiàn)出一致性。激素處理的煙苗各葉綠素含量變化有一定差異,且激素處理對(duì)QPTi總?cè)~綠素含量影響也是最大的，其下降趨勢(shì)高于QPT和WT植株。說(shuō)明QPT基因的正?；虺勘磉_(dá)對(duì)應(yīng)答高濃度激素介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用具有一定的補(bǔ)償作用,以消除該抑制效應(yīng)引起的植物生長(zhǎng)延滯現(xiàn)象。