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正常高密度脂蛋白(high density lipoproteins， HDL)因其可逆向轉(zhuǎn)運(yùn)血液中膽固醇至肝臟而具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和降低不良心血管事件發(fā)生率的作用[1-2]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，正常HDL除了逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇外，還具有抗炎、抗氧化、抗凝、促進(jìn)血管新生和保護(hù)內(nèi)皮舒張功能等作用[3-4]。然而，越來(lái)越多的研究顯示，疾病狀態(tài)下由于機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變，病人體內(nèi)的HDL失去了原有的保護(hù)作用：如糖尿病、慢性腎功能不全及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病人體內(nèi)HDL的促炎作用增強(qiáng)、失去了抗低密度脂蛋白(low density lipoproteins， LDL)衍生氧化脂質(zhì)的能力等[5-6]。近期有研究發(fā)現(xiàn)冠心病病人體內(nèi)HDL抗氧化能力及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成能力較正常HDL減弱[7]。然而冠心病病人體內(nèi)HDL抑制血管新生的機(jī)制尚不明確，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活化與細(xì)胞的增殖、分化及血管新生密切相關(guān)，而且有研究提示ERK可以作為治療血管新生的靶標(biāo)[8-9]。

急性心肌梗死(acute myocardial infarction， AMI)時(shí)冠狀動(dòng)脈血管缺血導(dǎo)致心急組織壞死，病人體內(nèi)各種炎性因子激活，此時(shí)的HDL是否通過(guò)ERK通路參與抑制血管新生是本課題研究的關(guān)鍵所在，這也將為尋求新的促進(jìn)AMI病人血管新生提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 AMI組為2016年3月—2016年9月就診于延安大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科AMI病人50例，心電圖ST段抬高或不抬高，排除罹患糖尿病、嚴(yán)重感染性疾病、腎衰竭等可能影響HDL功能的疾病病人，年齡40歲～63歲(43.57歲±8.84歲)。健康對(duì)照組(C組，38例)為2016年3月—2016年9月于延安大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢者， 年齡35歲～ 60歲(40.58歲±9.66歲)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。本研究已通過(guò)延安大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 HDL提取 按文獻(xiàn)記錄方法提取HDL[7]。首先抽取兩組參與者的空腹靜脈血液，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室并離心(4 000 r/min，4 ℃，10 min)提取上層血漿，按1∶500 加入乙二胺四乙酸(ethylenedinitrilo tetraacetic acid， EDTA， 134 mmol/L)和1∶10 000加入2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene， BHT， 200 mmol/L)，之后置入超高速離心機(jī)離心(50 000 r/min，4 ℃，21 h)。離心結(jié)束后血漿脂蛋白因其密度差異而分層：乳糜顆粒(最上層，乳白色)、水(第二層)、LDL(第三層，橘黃色)、HDL(第四層、亮綠色)、雜質(zhì)(底層、橘紅色)。用無(wú)菌注射器吸取HDL層面(不可避免吸取LDL及雜質(zhì))，然后再次按第1次離心條件離心后再次吸取HDL層面，最后再按上述條件離心后第3次后HDL基本提純。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Thermo公司)測(cè)定HDL濃度，置4℃冰箱備用(可儲(chǔ)存約3周)。

1.3 HUVEC中ERK1/2蛋白的檢測(cè) 取4代～6代HUVEC(ScienCell公司)種植于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞鋪滿瓶底后加入各組HDL進(jìn)行孵育。實(shí)驗(yàn)分組：空白組(blank組，不做處理)、C組(加C組HDL， 終濃度100 μg/mL)、AMI組(加AMI組HDL， 終濃度100 μg/mL)。孵育30 min后用預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液(CST公司)裂解細(xì)胞，然后經(jīng)超聲充分破碎后細(xì)胞蛋白后離心(4 ℃，12 000 r/min 10 min)并取上層蛋白液，經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后用Western blot檢測(cè)ERK1/2蛋白及其磷酸化位點(diǎn)的變化。

1.4 血管新生的檢測(cè)[7]首先鋪膠：取等量的預(yù)冷DMEM(GIBCO公司)與Matrix gel(R&D公司)混勻后置冰上，然后將配好的Matrix gel加入預(yù)冷的48孔板內(nèi)，每孔加入150 μL的Matrix gel，輕輕震蕩孔板以使Matrix gel均勻鋪滿板底，將孔板置入細(xì)胞培養(yǎng)箱20 min使其凝固(期間可準(zhǔn)備細(xì)胞)。取4～6代HUVEC細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至(2～3)×105個(gè)/mL后向孔板內(nèi)每孔加入300 μL。然后加入HDL進(jìn)行孵育，實(shí)驗(yàn)分組：空白組(blank組，不做處理)，C組(加C組HDL， 終濃度100 μg/mL、C+PD組(提前用PD98059孵育30 min后再加C組100 μg/mL 的HDL)，AMI組(加AMI組HDL， 終濃度100 μg/mL)，AMI+PD組(提前用PD98059孵育30 min后再加AMI組100 μg/mL 的HDL)。HDL孵育12 h后用顯微鏡下對(duì)孔板進(jìn)行拍照和記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 健康對(duì)照組與AMI組臨床資料比較 AMI組血脂水平偏高，C組、AMI組在年齡、性別、體重指數(shù)等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 各組HDL對(duì)HUVEC中ERK1/2及其磷酸化位點(diǎn)表達(dá)變化的影響 與空白組比較，C組HDL輕微升高ERK1/2蛋白磷酸化，但二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖1A)，AMI組HDL明顯抑制了ERK1/2蛋白的磷酸化(P<0.05)，見(jiàn)圖1A)；ERK1/2總的蛋白表達(dá)不受HDL的影響(見(jiàn)圖1B)。

圖1 各組HDL對(duì)HUVEC中ERK1/2及其磷酸化位點(diǎn)表達(dá)變化的影響

2.3 HDL對(duì)HUVEC血管新生的影響 與blank組比較，C組和AMI組HDL均可促進(jìn)HUVEC管狀形成(P<0.05)，但AMI組HDL促進(jìn)管狀形成的能力明顯較C組HDL減弱(P<0.05)；PD98059的預(yù)處理阻斷了HDL對(duì)HUVEC管狀形成的影響(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2。

圖A：與blank組比較，C組HDL促進(jìn)HUVEC管狀形成，AMI組HDL促進(jìn)管狀形成的能力較C組明顯減弱；ERK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059的應(yīng)用抑制了HDL對(duì)管狀形成的影響。圖B： 將圖A轉(zhuǎn)換為數(shù)值后的柱狀圖。

3 討 論

在動(dòng)物模型上發(fā)揮優(yōu)異療效的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)應(yīng)用到臨床實(shí)踐中時(shí)卻無(wú)法達(dá)到預(yù)期的療效[10-11]。仔細(xì)研讀以往研究報(bào)道后發(fā)現(xiàn)，過(guò)去成功案例的報(bào)道均是用正常的動(dòng)物建立心肌缺血模型后應(yīng)用生長(zhǎng)因子[12-13]，然而臨床實(shí)際中的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病人大多數(shù)是高脂血癥導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化引起的，高脂血癥時(shí)的某些成分或高脂血癥使體內(nèi)某些改變的物質(zhì)也許影響了VEGF對(duì)心肌缺血或心肌梗死心肌血管新生的治療效果。

機(jī)體內(nèi)的HDL并不是一成不變的，在疾病狀態(tài)下HDL原有的保護(hù)心血管疾病的功能較正常HDL減弱了很多，甚至在疾病狀態(tài)下的HDL還出現(xiàn)了損害心血管的表現(xiàn)[14-15]，如糖尿病病人HDL損害了內(nèi)皮依賴的血管舒張功能，冠心病病人HDL活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)及產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)的能力受損。 李蕓等[7]研究顯示：冠心病病人體內(nèi)HDL的抗氧化能力和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成的促進(jìn)作用減弱。但是冠心病病人HDL影響血管新生的具體機(jī)制尚不明了，血管新生的過(guò)程包含了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和最終分化為血管，并且這一過(guò)程還包含了各種信號(hào)通路和生長(zhǎng)因子的參與[16]。ERK信號(hào)通路的活化參與了血管新生的整個(gè)過(guò)程(包含內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移分化以及血管新生)，而且有研究顯示ERK可以作為治療血管新生的靶標(biāo)[8-9]。ERK也被證明是VEGF刺激血管新生的信號(hào)通路之一[17-18]。本研究以正常人群的HDL和AMI病人體內(nèi)的HDL為研究對(duì)象，通過(guò)比較兩者對(duì)HUVEC管狀形成和ERK1/2蛋白磷酸化表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)：正常HDL通過(guò)刺激ERK1/2蛋白的磷酸化促進(jìn)HUVEC管狀形成，而AMI病人體內(nèi)的HDL通過(guò)阻斷ERK1/2蛋白的磷酸化抑制HUVEC管狀形成。

本研究：與空白組比較，對(duì)照組(C組)HDL輕微刺激HUVEC中ERK1/2蛋白的磷酸化，但與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AMI組HDL明顯抑制HUVEC中ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.05)，且其刺激HUVEC管狀形成的能力較C組HDL明顯減弱(P<0.05)。提示AMI病人體內(nèi)的HDL失去原有促進(jìn)血管新生的機(jī)制之一是抑制了ERK1/2的磷酸化。

AMI病人體內(nèi)的HDL通過(guò)阻斷HUVEC中ERK1/2蛋白的磷酸化抑制HUVEC管狀形成。這一結(jié)果進(jìn)一步闡明了相較于濃度升高，HDL功能的正常對(duì)其發(fā)揮心血管保護(hù)作用有著更重要意義。