陳萬紫，陳加弟，黃慧芳

范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）是一種常染色體或X連鎖的隱性遺傳性疾病，為最常見的遺傳性骨髓衰竭綜合征，其發(fā)病率為1／106～5／106，基因攜帶率為1／300，臨床表現(xiàn)主要有多樣化先天畸形、進行性骨髓衰竭、皮膚黏膜色素沉著和易發(fā)惡性腫瘤等［1－3］。細胞染色體斷裂實驗是診斷FA的經(jīng)典方法，但是存在診斷周期長、細胞培養(yǎng)及染色體制備有失敗風險等缺點；且FA嵌合患者對絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）不敏感，可使染色體斷裂實驗出現(xiàn)假陰性，所以染色體斷裂實驗對體細胞嵌合FA患者常不適用，因此分子檢測對FA的診斷顯得尤其重要。以往常采用FA各相關(guān)基因外顯子測序及與多重連接探針擴增技術(shù)相結(jié)合或Western－blot、免疫沉淀法、逆轉(zhuǎn)錄PCR等方法對FA進行突變檢測［4］。這些方法雖也能有效檢測蛋白表達、點突變和大片段缺失／插入，但常需多種方法聯(lián)合使用，操作繁瑣，耗時長。二代測序技術(shù)因其高通量、高準確性及高速度等特點，已越來越多地應用于臨床診斷中［5］。本實驗采用二代測序聯(lián)合染色體斷裂實驗對2例疑似FA的患兒及其父母進行5種常見FA相關(guān)基因突變的檢測，報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2015年就診于血液科的患兒2例?；純?，女，3歲，以“血小板減少”為主訴就診。貧血面容，全身皮膚黏膜蒼白，可見陳舊性瘀點、瘀斑，未見其他明顯色素沉著。血常規(guī)示：白細胞3.60×109L－1，中性粒細胞0.87×109L－1，血紅蛋白46g／L，血小板14×109L－1。生化檢查、B超、X線拍片均未顯示異常，Coombs實驗陰性，抗血小板抗體陰性。骨髓形態(tài)學檢查：有核細胞增生減低，粒系略減低，紅系增生減低，全片巨核細胞8個，血小板少見?；純?，男性，7歲，以“面色蒼白5月余”為主訴就診。貧血面容，全身皮膚黏膜蒼白，未見明顯肢體畸形、色素沉著。血常規(guī)示：白細胞2.79×109L－1，中性粒細胞0.63×109L－1，血紅蛋白68g／L，血小板35×109L－1。生化檢查大致正常，Coombs實驗陰性，抗血小板抗體陰性。骨髓形態(tài)學檢查：有核細胞增生極度減低，且粒紅細胞比值減低，非造血細胞易見，全片巨核細胞2個，血小板罕見，就診時擬診“再生障礙性貧血”，但經(jīng)治療后血象未見明顯好轉(zhuǎn)。同時收集2個患兒父母的外周血，另取無血液系統(tǒng)疾病兒童的外周血作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 MMC誘導的染色體斷裂實驗 采集肝素抗凝的外周血2mL。5mL外周血培養(yǎng)基（1640培養(yǎng)基＋15%小牛血清＋PHA＋青／鏈霉素）中分別加入0.5mL外周血和 MMC（終濃度為0，25，50，100ng／mL），培養(yǎng)66～72h后加入秋水仙胺應用液，阻斷3～5h，收獲，低滲15min，常規(guī)制片，Gimsa染色，鏡檢。染色體斷裂計數(shù)：染色體（單體）斷裂、染色體（單體）裂隙、染色體的碎片、末端丟失和中間丟失各計為1斷裂；雙著絲粒、環(huán)狀染色體、三射體、四射體各計為2個斷裂。每組各計數(shù)30個分裂相，分析患兒與對照（n＝10）的平均斷裂率。

1.2.2 二代測序檢測FA相關(guān)基因突變 采用Ion AmpliSeqTMDesigner進行引物設計及合成；采用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0試劑盒（美國Thermo Fisher公司），按照說明書構(gòu)建文庫。之后進行 模板 制 備，主要采 用 Ion PGMTMHi QTMTemplate Kit試劑盒（美國 Thermo Fisher公司），按照說明書進行操作，使用Ion One TouchTM2Instrument進行乳液PCR，采用Ion One TouchTMES富集模板陽性的ISPs，然后使用Ion PGMTMHi－QTMSequencing Kit試劑盒、Ion 316TMChip Kit v2以及Ion PGMTMSystem，按照說明書進行測序操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用Ion ReporterTM軟件分析突變，利用dbSNP、1000Genome與PolyPhen2數(shù)據(jù)庫進行變異注釋以及氨基酸突變分析。

2 結(jié) 果

2.1 患兒1的染色體斷裂實驗和基因突變檢測結(jié)果 染色體斷裂實驗結(jié)果顯示，未加入MMC時，染色體均未發(fā)生斷裂。MMC濃度為25ng／mL時，染色體畸變率未明顯高于對照組；MMC濃度為50與100ng／mL時，染色體畸變率分別為23.33%和44.33%，均高于相應濃度對照組的畸變率（14.67%和26.67%）。二代測序結(jié)果顯示，檢測到FANC C的基因突變，突變位點為C.973G＞A／p.A325，該突變?yōu)殡s合型，其母親基因結(jié)果為陰性，而其父親檢測到了對應位點的基因突變，表明雜合突變基因遺傳自父親。

2.2 患兒2的染色體斷裂實驗和基因突變檢測結(jié)果 染色體斷裂實驗結(jié)果顯示，MMC濃度為25，50和100ng／mL時，染色體畸變率分別為13.33%，56.67%和76.67%，均明顯高于相應濃度對照組的畸變率（5.33%，14.67%和26.67%），且較易見到有三射體或四射體的分裂相（圖1）。二代測序結(jié)果顯示，其父親有FANC A基因突變，突變位點有c.A796G＞p.T266A、c.A3982G＞p.T1328A，其突變屬于雜合型；其母親的基因結(jié)果為陰性。另患兒2還檢出2個位點的突變：c.G2426A＞p.G809D、c.G1235T＞p.A412V（表1）。

圖1 MMC誘導的染色體斷裂示意圖（ ×1 000）Fig 1 Chromosome breakage after MMC treatment（ ×1 000）

表1 患兒2FA相關(guān)基因突變檢測結(jié)果Tab 1 Results of FA genetic mutation detection

3 討 論

FA是一種常染色體或X連鎖隱性遺傳病，常有各種先天畸形，如指趾畸形、泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育不全、橈骨缺如等。隨著年齡的增長，F(xiàn)A患者逐漸表現(xiàn)出體格、智力發(fā)育滯后和血細胞一系或多系減少［6－7］。國內(nèi)對FA疾病的認識不足，根據(jù)典型的肢體畸形及全血細胞減少等臨床特征只可作出初步的診斷，F(xiàn)A的遺傳學診斷尤其是基因水平的診斷在國內(nèi)開展還較少，因此，國內(nèi)FA的診斷率遠遠低于國外。FA患者尤其是無明顯的先天畸形、智力發(fā)育障礙、骨髓衰竭和繼發(fā)腫瘤的患者，診斷較為困難，易漏診和誤診。

FA的診斷除根據(jù)臨床表現(xiàn)外，還需有FA致病基因檢測陽性或染色體斷裂實驗陽性［8］。染色體斷裂實驗是最經(jīng)典的FA確診方法，但是染色體斷裂實驗有可能出現(xiàn)假陽性，特別是3月內(nèi)接受化療或放療者；且FA的嵌合體患者對DNA交聯(lián)劑不敏感，常出現(xiàn)假陰性結(jié)果。有報道指出，部分FA患者血中存在2個細胞亞群［1，9－11］，一個對 DNA 交聯(lián)劑如MMC敏感，另一個對交聯(lián)劑不敏感，此現(xiàn)象稱之為嵌合現(xiàn)象。嵌合現(xiàn)象在FA患者的發(fā)生率為20%～30%，染色體斷裂實驗對體細胞嵌合FA患者常不適用，且染色體斷裂實驗特異性不足，因為有些罕見基因改變也會導致染色體不穩(wěn)定，從而引起陽性結(jié)果。本研究中，患兒2的染色體斷裂實驗結(jié)果顯示，在低濃度MMC誘導下即表現(xiàn)為染色體斷裂實驗陽性；而患兒1在MMC濃度＞50ng／mL時染色體畸變率才明顯高于對照組，而在MMC濃度＜50ng／mL時，染色體畸變率并無明顯變化，提示該患者可能為FA的嵌合體。但要確診為FA還需提供更有力的證據(jù)，基因檢測就顯得尤為重要。目前，對于該病的認識已從染色體水平發(fā)展到基因?qū)W診斷水平。由于FA涉及17種基因，這些基因散布于整個基因組，大多數(shù)FA患者存在FA基因突變，且每個基因存在多種突變形式，如基因大片段缺失和插入、終止突變、錯義和框移突變等［12］。FA基因突變類型與其相應的FA亞型臨床表現(xiàn)的嚴重程度密切相關(guān)。比如FA的G亞型比C與A亞型更易進展為骨髓增生異常綜合征或急性髓細胞白血?。?3］。也有研究表明，基因亞型的分析對臨床治療方案的選擇很重要，如A亞型患者傾向于晚期發(fā)生骨髓衰竭，C和G亞型則有更嚴重的臨床過程，可能需要較早進行骨髓移植。本實驗采用二代測序的方法對2個患兒及其父母進行基因突變的檢測，患兒1檢測到FANC C的基因突變，位點為C.973G＞A／p.A325，且其父親也檢測到同一位點的基因突變，表明突變是由其父親遺傳的，這不僅為其診斷提供了有力的證據(jù)，也可以確定其基因型，有利于臨床治療方案的選擇，讓醫(yī)生能夠在患者的醫(yī)療中準確利用基因型或表型之間的關(guān)系?；純?也檢測到FANC A的基因突變，除了有其父親的2個位點突變（c.A796G＞p.T266A，c.A3982G＞p.T1328A）外，還檢出了另外2個位點的突變：c.G1235T＞p.A412V，c.G2426A＞p.G809D。不僅證實了雜合突變基因為其父所攜帶的突變基因，也對其治療及預后的判斷有重要的臨床價值。研究表明，影響FA預后的最主要因素是基因型［14］。Faivre等報道，F(xiàn)ANC A雙等位基因無效突變所導致的FANC A蛋白缺失的患者有早發(fā)貧血傾向且更易進展為急性髓細胞白血病，且診斷后的生存期更短［15］。

FA病因為累及單個FA基因的純合突變或復合雜合突變。大多數(shù)FA基因都需要2個等位基因均喪失正常功能才會引起疾病。因此，有效開展FA基因檢測鑒定FA患者不同的基因突變至關(guān)重要，二代測序可以應用于任意基因突變的檢測［16］。本研究利用二代測序技術(shù)對FA患者進行常見FA相關(guān)基因突變的檢測，為2個患兒的臨床診斷和確定亞型提供了有力的證據(jù)。本研究采用的二代測序可為臨床提供更加全面的基因信息，而且可以大大提高檢測速度，減少FA基因測序的時間，縮短診斷周期［17－18］，提高臨床診斷的可靠性，還可進一步明確FA基因突變與FA臨床表型的關(guān)系。因此，對懷疑FA的患者建議進行FA基因測序以識別基因缺陷，有助于確診FA，尤其是嵌合的患者，還有利于鑒別診斷FA與其他非FA的染色體斷裂性疾病。