吳宏霞，林 媚，石冬梅，唐淑榕，李光文，沈龍華

鹽酸左氧氟沙星（levofloxacin hydrochloride，LVFX）是第三代喹諾酮類(lèi)藥物氧氟沙星的左旋同分異構(gòu)體，其抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、副作用少，與其他抗菌藥很少交叉耐藥，且在房水中的濃度高于其他喹諾酮類(lèi)藥物，是目前公認(rèn)的療效顯著的眼科抗菌藥，廣泛用于治療角膜炎、結(jié)膜炎、角膜潰瘍、眼瞼炎、瞼腺炎、淚囊炎等眼部疾患及手術(shù)前后的預(yù)防［1－3］。與大多數(shù)眼用液體制劑類(lèi)似，由于結(jié)膜囊內(nèi)淚液的分泌和沖洗，LVFX普通滴眼液使用后藥效維持時(shí)間短，僅有不足5%的藥量到達(dá)眼內(nèi)組織［4］，需頻繁給藥，患者依從性差。

溫敏凝膠（thermosensitive in－situ gels，TISG）是一類(lèi)對(duì)溫度敏感的智能凝膠，以泊洛沙姆（poloxamer）為基質(zhì)的TISG在常溫下為溶液，便于患者給藥，滴入眼穹隆后形成凝膠，體系黏度瞬間增大，防止藥液流失，延長(zhǎng)藥物眼部滯留時(shí)間［5］。

為提高眼用制劑的生物利用度，本研究制備了LVFX殼聚糖納米粒（LVFX－NPs），并采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）－響應(yīng)曲面法 （response surface methodology，RSM）篩 選TISG基質(zhì)泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的最佳比例，制成眼部給藥后立刻膠凝的滴眼液（LVFXNPs－TISG），結(jié)合納米粒的緩慢釋放與原位凝膠延長(zhǎng)滯留的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步增加藥物的眼部生物利用度，同時(shí)考察其體外釋藥行為，為體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 LVFX（批號(hào)：10012016A，福州飛凈生物科技有限公司）；殼聚糖（CS，脫乙酰度≥95%，黏度100～200mpa·s，批號(hào)K1520258，阿拉丁試劑上海有限公司）；泊洛沙姆407和188（批號(hào)分別為WPAK588B及WPAK527B，德國(guó)BASF公司）；人工淚液（自制，氯化鈉6.42g，碳酸氫鈉1.42g，二水氯化鈣0.11g，氯化鉀1.11g，加入純化水定容至1L）；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器 透射電子顯微鏡（HT7700，日立高新技術(shù)公司）；激光粒度儀（Z3000，美國(guó)PSS公司）；高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 15R，香港力康發(fā)展有限公司）；高效液相色譜儀（LC－15C，日本島津）；電子天平（AL204，梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；冷凍干燥機(jī)（LGJ－10C型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；磁力攪拌器（79－1，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；恒溫振蕩器（SHA－B，常州國(guó)華儀器有限公司）；pH計(jì)（PHS－3E，上海儀電科學(xué)儀器股份公司）；Millipore超濾離心管（3000Da，德國(guó)默克集團(tuán)）。

1.2 方法

1.2.1 LVFX－NPs－TISG 的制備 稱(chēng)取適量 CS溶于0.5%醋酸水溶液20mL中，制得澄清的CS高分子水溶液（1.8g／L）。將處方量的LVFX加入CS溶液，磁力攪拌下以1mol／L的NaOH溶液緩慢滴加，調(diào)節(jié) pH 值至5.1，將 TPP 水溶液（1mg／mL）以每分鐘3滴的速度均勻滴入持續(xù)攪拌的溶液中（600r／min），滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌60min，過(guò)0.8μm 微孔濾膜，得 LVFX－NPs，稀釋10倍后以2%磷鎢酸染色，透射電鏡下觀察形態(tài)，激光粒度儀測(cè)定其粒徑。將此膠體溶液置于15mL超濾管，4℃下離心（7 000r／min）45min，濾液用來(lái)測(cè)定包封率，同時(shí)收集超濾管內(nèi)膠體，冷凍干燥得載藥納米粒粉末，并稱(chēng)定總質(zhì)量以計(jì)算載藥量。

按處方量取純化水于10mL西林瓶中，將載藥納米粒粉末撒入水中溶脹，加入處方量的泊洛沙姆407和188，4℃冰箱靜置，得澄明載藥LVFX－NPs－TISG。以LVFX代替載藥納米粒粉末，同法制備得LVFX普通凝膠（LVFX－TISG）。

1.2.2 納米粒包封率和載藥量的測(cè)定 采用反相高效液相色譜法檢測(cè)LVFX的含量。色譜柱：InertSustain C 18（150mm×4.6mm；5μm）；流動(dòng)相：磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH＝3）－乙腈（85∶15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：293nm；流速：1.0mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL。

將上述離子凝膠法制備的LVFX－NPs膠體溶液超濾離心后的濾液，以高效液相色譜法測(cè)定LVFX的含量，同時(shí)根據(jù)投藥量和冷凍干燥后納米粒粉末的質(zhì)量，按以下公式計(jì)算納米粒的包封率和載藥量。

1.2.3 膠凝溫度的測(cè)定 采用溫度計(jì)目測(cè)法測(cè)定膠凝溫度［6］。將精度為0.1℃的溫度計(jì)插入裝有5g LVFX－NPs－TISG滴眼液的西林瓶中，溫度計(jì)的水銀球完全沒(méi)入溶液中。將西林瓶置于恒溫水浴鍋中緩慢升溫（0.1℃／min），每升高0.1℃，取出西林瓶一次，迅速傾斜45°～60°，觀察滴眼液是否流動(dòng)。當(dāng)試管內(nèi)液體不發(fā)生流動(dòng)、形成凝膠時(shí)的溫度記為膠凝溫度T1（無(wú)淚液膠凝溫度）。另往LVFX－NPs－TISG滴眼液中加入人工淚液混勻（滴眼液∶人工淚液＝40∶7）［7］，測(cè)得的膠凝溫度為T(mén)2（含淚液膠凝溫度）。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 LVFX－NPs－TISG的處方優(yōu)化

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 由文獻(xiàn)［8］可知，在泊洛沙姆407凝膠基質(zhì)中加入泊洛沙姆188，可提高處方的膠凝溫度。為了獲得室溫下呈液態(tài)、滴入眼穹隆被淚液稀釋后立刻膠凝化的基質(zhì)，以泊洛沙姆407的濃度（X1：18%～26%）和泊洛沙姆188的濃度（X2：0～6%）為考察因素，根據(jù)中心復(fù)合設(shè)計(jì)－效應(yīng)曲面原理安排各因素水平的代碼值和操作值，采用二因素五水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素和水平Tab 1 Factors and levels in central composite design

1.2.4.2 模型擬合及最優(yōu)選擇 采用通用數(shù)值分析軟件MATLAB，以T1和T2為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)各因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸，回歸方程的通用表達(dá)為：

隨后根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化設(shè)計(jì)理論，建立基于所生成效應(yīng)面回歸方程的優(yōu)化數(shù)學(xué)模型。該模型選擇設(shè)計(jì)變量＝［X1，X2］T，其中 X1為表征泊洛沙姆407濃度的因素（%），X2為表征泊洛沙姆188濃度的因素（%）。確定目標(biāo)函數(shù)minf）＝｜T1－T2｜，其中T1和T2分別用前述2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的二次多項(xiàng)式回歸方程代入，該目標(biāo)函數(shù)是希望實(shí)現(xiàn)經(jīng)淚液稀釋后膠凝溫度T2與未經(jīng)稀釋的膠凝溫度T1差值最小，以保證滴眼液在儲(chǔ)存時(shí)呈現(xiàn)液態(tài)，滴入眼球表面則迅速膠凝化。模型的約束條件包括25≤T1≤30和30≤T2≤35，表征膠凝溫度的控溫范圍。通過(guò)對(duì)該數(shù)學(xué)模型的求解即可得出最優(yōu)化處方設(shè)計(jì)。

1.2.5 藥物體外釋放行為考察 采用文獻(xiàn)［9］的方法，精密稱(chēng)取LVFX－NPs－TISG 2.0g于5mL低型燒杯中，34℃下充分膠凝后置于溶出杯底部，加入溫度為（34±0.5）℃的人工淚液200mL，轉(zhuǎn)速為100r／min，于第0.5，1，2，3，4，6，8，12，24h各取樣1mL，并補(bǔ)充1mL等溫淚液。樣品經(jīng)超濾管離心過(guò)濾后，取濾液進(jìn)樣測(cè)定濃度并計(jì)算累積釋藥百分率Q，同法測(cè)定LVFX－TISG的累積百分率。

2 結(jié) 果

2.1 LVFX－NPs的形態(tài)、粒徑、包封率及載藥量納米粒形態(tài)圓整，分布均勻，平均粒徑為（60.7±5.1）nm，多分散指數(shù)為（0.18±0.03），Zeta電 位 為 （32 ± 1.5）mV。 藥 物 包 封 率 為（62.5±1.8）%，載藥量為（10.43±0.30）%（圖1）。

2.2 模型擬合 根據(jù)表1安排實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。分析數(shù)據(jù)后，關(guān)于T1和T2的計(jì)算結(jié)果分別如表3，4所示。

T1的二次多項(xiàng)式回歸數(shù)學(xué)模型為：

模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r＝0.997 2，結(jié)合P值檢驗(yàn)結(jié)果，該模型具有較高的可信度。

根據(jù)P檢驗(yàn)的情況，T2的回歸模型中，b4項(xiàng)的P值達(dá)到0.339 8，該項(xiàng)的可信度低，予以刪除后重新擬合，結(jié)果如表5所示。

圖1 LVFX－NPs透射電鏡圖Fig 1 Transmission electron microscope image of LVFX－NPs

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Central composite design for the variation with experimental results

表3 T1的二次多項(xiàng)式回歸結(jié)果Tab 3 Results of two polynomial regression of T1

表4 T2的二次多項(xiàng)式回歸結(jié)果Tab 4 Results of two polynomial regression of T2

表5 刪減后關(guān)于T2的二次多項(xiàng)式回歸結(jié)果Tab 5 Two polynomial regression of T2after deletion

T2的二次多項(xiàng)式回歸數(shù)學(xué)模型為：

模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r＝0.993 6，結(jié)合表5的檢驗(yàn)結(jié)果，該模型具有較高的可信度。

根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，分別繪制各指標(biāo)的三維效應(yīng)面和二維等高線圖（圖2），研究不同濃度泊洛沙姆407和泊洛沙姆188在無(wú)淚液及有淚液稀釋的情況下對(duì)膠凝溫度的影響，通過(guò)等高線圖重疊，選取室溫下（25℃）呈液體狀態(tài)、便于滴入眼睛、在眼球表面溫度（34℃）下能立刻發(fā)生相轉(zhuǎn)變凝結(jié)成固態(tài)、便于粘附于角膜和結(jié)膜囊表面的處方的區(qū)域（圖3）。

圖2 LVFX－NPs－TISG的膠凝溫度對(duì)泊洛沙姆407和188的效應(yīng)面與等高線圖Fig 2 The response surface and contour map of poloxamer 407and 188on the gelation temperature of LVFX－NPs－TISG

圖3 二維等高線疊加圖（等高線交集區(qū)域?yàn)閮?yōu)化區(qū)域）Fig 3 Two－dimensional contour map（the intersection area of contour lines is the optimal region）

根據(jù)圖3，選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的可行處方設(shè)計(jì)，即在等高線疊加圖中選擇滿(mǎn)足25≤T1≤30和30≤T2≤35的點(diǎn)，如表6中處方1～4所示。

2.3 最佳處方設(shè)計(jì) 在MATLAB軟件中選用內(nèi)點(diǎn)懲罰函數(shù)法進(jìn)行非線性規(guī)劃求解，可得最佳處方設(shè)計(jì) 方 案 為 X1＝22.014 2、X2＝6.000 0，此 時(shí)｜T1－T2｜＝7.288 3，即表6中優(yōu)化為圓整后的最佳處方。

2.4 處方的驗(yàn)證 4個(gè)直觀觀察挑選的處方及優(yōu)化設(shè)計(jì)的最優(yōu)處方在未經(jīng)處理和經(jīng)模擬淚液稀釋后，膠凝溫度實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值偏差均＜5%，表明所擬合方程預(yù)測(cè)性較好。

2.5 體外釋藥結(jié)果 以藥物累積釋放率Q對(duì)時(shí)間t作圖，分別得到LVFX－TISG的經(jīng)時(shí)釋放曲線（圖4）。LVFX－TISG溶蝕快，大約5h完全溶蝕（此時(shí)累積釋放率為94.7%）。以前面5h的累積釋放率對(duì)時(shí)間回歸，得回歸方程：

LVFX－NPs－TISG 24h釋放總量達(dá)到71.9%。

表6 驗(yàn)證處方的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值Tab 6 Comparison of predicted values and measured values

圖4 LVFX－NPs－TISG的體外釋放曲線Fig 4 In vitro release profiles of LVFX－NPs－TISG

3 討 論

CS是自然界存在的唯一堿性多糖，其結(jié)構(gòu)中的氨基與角膜中帶負(fù)電荷的陰離子糖蛋白結(jié)合或反應(yīng)形成藥物儲(chǔ)庫(kù)，具有優(yōu)良的黏膜粘附性［10］。預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入LVFX－NPs后，處方膠凝溫度整體下降0.2～2℃，即CS可增強(qiáng)泊洛沙姆的膠凝能力，增強(qiáng)緩釋效果，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11－12］。

本研究將載藥納米粒分散在TISG中，理想的眼用TISG應(yīng)在使用前為液體，滴入眼穹隆立即形成凝膠。因此，本實(shí)驗(yàn)采用載藥納米粒TISG經(jīng)模擬淚液稀釋前后的膠凝溫度T1及T2為處方評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同濃度泊洛沙姆407和泊洛沙姆188在無(wú)淚液及有淚液稀釋的情況下對(duì)膠凝溫度的影響，通過(guò)中心復(fù)合設(shè)計(jì)－響應(yīng)曲面法對(duì)膠凝溫度受泊洛沙姆型號(hào)和濃度的影響進(jìn)行試驗(yàn)、建模和數(shù)據(jù)分析，建立基于所生成效應(yīng)面回歸方程的優(yōu)化數(shù)學(xué)模型，運(yùn)用圖形技術(shù)將膠凝溫度與泊洛沙姆的關(guān)系顯示出來(lái)，可供實(shí)驗(yàn)者憑借直觀的觀察來(lái)選擇優(yōu)化條件［13］。本研究則通過(guò)對(duì)優(yōu)化模型的求解獲得最佳處方設(shè)計(jì)，結(jié)果顯示，優(yōu)化的處方實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值偏差小，表明擬合的數(shù)學(xué)模型在因素優(yōu)化過(guò)程中是可行的。所用方法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，結(jié)果直觀，實(shí)驗(yàn)精度高，結(jié)果重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

測(cè)定納米粒TISG體外釋放度時(shí)，需兼顧TISG的性質(zhì)和納米制劑的釋放特點(diǎn)。TISG的體外釋放通常采用正向動(dòng)態(tài)透析袋法、Franz擴(kuò)散池法和無(wú)膜法［14－15］。透析法操作簡(jiǎn)便，取樣后無(wú)需過(guò)濾分離，也可直接用于納米制劑的體外釋放測(cè)定。但釋放后的藥物需要通過(guò)透析膜緩慢與外界介質(zhì)交換，藥物未處于完全的漏槽狀態(tài)［10］，與實(shí)際眼部給藥時(shí)藥物的釋放有一定差異。擴(kuò)散池法釋藥面積固定，溫敏原位凝膠在凝膠狀時(shí)存在剪切稀釋特性，隨著眼睛眨動(dòng)，會(huì)在眼球表面進(jìn)行重新分布，故給藥后滲透速率和滲透總量將高于擴(kuò)散池法［16］。無(wú)膜法在TISG體外釋放中使用最廣泛，其優(yōu)點(diǎn)是可模擬凝膠骨架在角膜前緩慢溶蝕的過(guò)程，但該法不能體現(xiàn)實(shí)際給藥時(shí)特殊的角膜結(jié)構(gòu)及凝膠在角膜表面的覆蓋。此外，無(wú)膜法溶蝕速度較快，納米粒釋放緩慢，照搬此法不符合藥物的實(shí)際釋放規(guī)律。本研究采用溶出儀釋放度法和無(wú)膜法結(jié)合，既能模擬凝膠在角膜前的溶蝕過(guò)程，也能反映溶蝕后藥物從納米粒中緩慢釋放的特點(diǎn)。

LVFX－TISG從TISG中的釋放遵循零級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，這是因?yàn)槟z基質(zhì)在溶出杯中溶蝕呈現(xiàn)零級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，藥物從TISG中的釋放速度由溶蝕速度控制。LVFX－NPs－TISG 24h 釋放總量 達(dá)71.9%，具有明顯的緩釋效果而無(wú)突釋效應(yīng)，這緣于常溫下液態(tài)的納米粒TISG升溫到眼表溫度后轉(zhuǎn)為半固體凝膠態(tài)，凝膠是按照零級(jí)動(dòng)力學(xué)逐步溶蝕的，故而納米粒中的藥物在溫敏原位凝膠中的釋放也更均勻平穩(wěn)。

近年來(lái)，眼用原位凝膠發(fā)展迅速，國(guó)外有Timoptic XE已經(jīng)上市，國(guó)內(nèi)也有多個(gè)產(chǎn)品處于臨床研究階段［11］，但是將原位凝膠運(yùn)用于納米粒載體系統(tǒng)的研究仍在初步階段。該給藥系統(tǒng)結(jié)合納米粒緩釋和原位凝膠延長(zhǎng)滯留時(shí)間的優(yōu)勢(shì)，又保留了液體制劑給藥方便、精確的優(yōu)點(diǎn)，減少給藥次數(shù)與藥物全身副作用，增加緩釋效果與生物利用度，有望成為眼部傳遞系統(tǒng)的新劑型，具有良好的應(yīng)用前景。