林怡瑄，鄭子赫，林悄響，溫智淵，賀 蛟，方秋娟

心肌炎是心肌的一種炎癥性疾病，可表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性進程，可伴有心肌的局灶性或彌漫性病變，可有全身疲勞、不適、胸痛、心源性休克、心律失常，甚至心搏驟停等臨床表現(xiàn)［1］。心肌炎初期表現(xiàn)隱匿，在青壯年的猝死原因中占比達20%［2］。有研究報道，黃芪、丹參等部分中草藥可改善病毒性心肌炎所致的心律失常和心肌酶譜異常［3］。甘草是藥食兼用的補益中草藥，甘草甜素（glycyrrhizin，GL）是其最主要的生理活性物質(zhì)，屬三萜衍生物，廣泛用于治療各種急慢性肝炎、支氣管炎和艾滋病，并有助于減輕缺血心肌損傷［4－6］。本實驗采用GL干預(yù)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的大鼠心肌炎模型，旨在為應(yīng)用GL防治心肌炎提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠33只，體質(zhì)量（190±10）g［福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（閩）2010－0001］。飼養(yǎng)期間，按標(biāo)準(zhǔn)要求維持環(huán)境的溫度及濕度等，提供足夠的飼料和飲水。實驗操作遵循動物倫理法規(guī)條例。

1.1.2 試劑 GL（純度98%，韶關(guān)市冠翔生物制品有限公司）；LPS（美國Sigma公司）；微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）及過氧化氫酶（catalase，CAT）測試盒（南京建成科技有限公司）；10%中性甲醛固定液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；Masson三色染色試劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.1.3 儀器 離心機（TDL－60B，常州市飛鴿醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀（Elx800，美國BioTek公司）；透射電鏡（EM208，荷蘭飛利浦公司）。

1.2 方法

1.2.1 制備LPS誘導(dǎo)的大鼠急性心肌炎模型SD大鼠33只，隨機分成3組（n＝11）：對照組（CON）、心肌炎模型組（MM）及 GL 治療組（MM＋GL）。CON組大鼠給予尾靜脈注射生理鹽水1mL／kg，其余2組注射 LPS（每周0.2mg／kg，連續(xù)4周，方法參照文獻［7］）；之后再給各組大鼠灌胃，其中CON組及MM組每天灌以生理鹽水10mL／kg，MM＋GL組每天灌以 GL 200mg／kg，連續(xù)4周。

1.2.2 檢測大鼠血清及心肌抗氧化代謝指標(biāo) 按照試劑盒說明，測血清CAT活性；制備心肌組織勻漿，測心肌組織的MDA，GSH和SOD含量。

1.2.3 H－E染色觀察心肌組織學(xué)結(jié)構(gòu) 取左心尖部心室內(nèi)膜下心肌組織，固定、脫水、包埋，制作心肌組織病理學(xué)切片。常規(guī)H－E染色，光鏡下觀察攝影。

1.2.4 Masson染色觀察心肌組織膠原纖維 將上述制備的心肌組織病理學(xué)切片，按Masson染色試劑盒說明書進行染色，光鏡下觀察攝影。

1.2.5 透射電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu) 取左心尖部心室內(nèi)膜下心肌標(biāo)本，切成1mm3大小的組織塊，按常規(guī)進行前固定、后固定、脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、半薄切片、定位、切片、染色，透射電鏡下觀察攝影。

2 結(jié) 果

2.1 GL干預(yù)對心肌炎大鼠心肌和血清指標(biāo)的影響 MM組的GSH含量及CAT活性低于CON組（P＜0.05），MDA及SOD含量與CON組差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。MM＋GL組的GSH高于MM組（P＜0.05），MDA，SOD 及 CAT 含量與MM組差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 GL干預(yù)對炎癥大鼠心肌組織MDA，SOD，GSH含量和血清CAT活性的影響Tab 1 The effects of GL on myocardium MDA，SOD，GSH and serum CAT activity in myocarditis rat model

2.2 GL干預(yù)對炎癥大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響H－E染色結(jié)果顯示，CON組心肌纖維完整、致密、粗細一致，心肌細胞核形態(tài)正常；MM組心肌組織間隙增寬，毛細血管擴張充血，炎癥細胞浸潤，水腫明顯，心肌纖維松散，粗細不均，部分肌纖維斷裂、溶解，細胞核扁平；MM＋GL組心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常（圖1）。

圖1 GL干預(yù)對炎癥大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響（H－E染色）Fig 1 The effects of GL intervention on myocardial structure in myocarditis rats（H－E staining）

2.3 GL干預(yù)對炎癥大鼠心肌纖維化的影響Masson染色觀察大鼠心肌組織膠原纖維，CON組及MM＋GL組心肌組織均未見明顯膠原纖維；MM組可見明顯的膠原纖維（圖2）。提示心肌炎模型組大鼠心肌纖維化，而GL干預(yù)可防止大鼠心肌組織纖維化。

2.4 GL干預(yù)對炎癥大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡觀察結(jié)果顯示，CON組細胞核輪廓清晰，形態(tài)正常；線粒體豐富，可見線粒體嵴；肌原纖維排列整齊，Z線明顯，可見M線，肌小節(jié)、肌絲形態(tài)完整。MM組細胞核輪廓不清，核周池腫脹；線粒體少，排列零亂，呈固縮狀態(tài)，或崩解消失，嵴模糊不清；肌原纖維呈波浪狀，肌絲溶解，模糊不清，Z線迂曲。MM＋GL組心肌細胞核、線粒體、肌原纖維結(jié)構(gòu)正常（圖3）。

3 討 論

LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的外膜成分，其釋放量的多寡決定了機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的類型，可用于誘導(dǎo)制備炎癥模型［8］。LPS進入血液循環(huán)后，首先與LPS結(jié)合蛋白和細胞表面的CD14分子結(jié)合，再與單核－巨噬細胞膜上Toll樣受體4結(jié)合，導(dǎo)致TLR4聚合而活化。LPS還可激活絲裂原激活的蛋白激酶通路，導(dǎo)致炎癥細胞因子大量產(chǎn)生和釋放［9］。

圖2 GL干預(yù)對炎癥大鼠心肌纖維化的影響（Masson染色）Fig 2 The effects of GL intervention on myocardial fibrosis in myocarditis rats（Masson staining）

圖3 GL干預(yù)對炎癥大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig 3 The effects of GL intervention on ultra－structure of myocardial cells in myocarditis rats

本研究顯示，成年大鼠尾靜脈間斷性注射低劑量LPS（每周0.2mg／kg，連續(xù)4周）后，心肌 GSH顯著降低、心肌SOD和血清CAT活性降低、心肌纖維松散和膠原纖維增多、心肌細胞超微結(jié)構(gòu)異常，提示LPS造成大鼠心肌抗氧化能力降低、結(jié)構(gòu)損傷和心肌纖維化。

既往研究也表明，GL可減輕柯薩奇病毒B3引起的小鼠心肌炎，但其治療劑量范圍窄［10－11］。本研究每天以GL（200mg／kg）干預(yù)炎癥性大鼠，結(jié)果顯示，該劑量GL可增強心肌的抗氧化能力，并維持心肌結(jié)構(gòu)正常。

適量的GL可能通過以下機制介導(dǎo)對大鼠心肌炎癥性疾病的保護作用：（1）GL改善大鼠心肌炎癥性疾病模型的抗氧化代謝：機體炎癥時自由基代謝異常，自由基化學(xué)性質(zhì)極為活潑，有強氧化作用，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。生理狀況下，自由基的生成和清除維持動態(tài)平衡，當(dāng)平衡被打破時，自由基在體內(nèi)大量堆積，造成組織的損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可損傷細胞膜；SOD廣泛存在于生物體內(nèi)，能催化O2－歧化反應(yīng)，保護細胞不受自由基傷害［12］；CAT廣泛存在于人體內(nèi)，催化過氧化氫分解為水和氧氣，使H2O2不與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成－OH［13］；GSH能與機體內(nèi)的自由基結(jié)合，清除自由基，為細胞提供抗氧化保護［14］。本研究提示，LPS造成大鼠心肌抗氧化能力降低，GL可明顯提高心肌GSH含量，減輕心肌MDA的升高和SOD的降低程度及增加血清CAT活性。說明GL可通過改善機體的抗氧化代謝，保護心肌防止炎癥損傷。（2）GL減輕心肌纖維化程度：心肌細胞為終末分化細胞，損傷后以纖維細胞進行修復(fù)。本研究顯示，LPS造成心肌組織損傷，膠原纖維增多；GL灌胃可保護心肌，減輕纖維化程度，從而改善心功能。（3）GL保護線粒體：線粒體是細胞有氧呼吸的場所，呼吸鏈對維持基本生命體征有重要意義。本研究顯示，MM組心肌線粒體結(jié)構(gòu)模糊和溢出，MM＋GL組心肌線粒體結(jié)構(gòu)維持正常。

綜上所述，每天給予GL（200mg／kg）可保護心肌結(jié)構(gòu)，防止炎癥損傷，其機制與GL增強機體抗氧化能力有關(guān)，但其效應(yīng)規(guī)律還有待于今后進一步研究。