蘭賀軍，趙振偉，賈 春

骨肉瘤惡性程度高，局部及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生早，預(yù)后不佳，骨肉瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是影響患者生存率和預(yù)后的關(guān)鍵因素，基因靶向治療一直是骨肉瘤研究中的熱點(diǎn)，而尋求有效的治療靶點(diǎn)成為需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一［1］。微小 RNA（microRNA，miR）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的調(diào)控性小分子RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3′－UTR完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制蛋白翻譯以調(diào)控基因的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞重要生物學(xué)的作用，間接起著“癌基因或抑癌基因”的功能［2－3］。miR－145被認(rèn)為是一種抑癌基因，在調(diào)控腫瘤的分化、發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵性作用［4］。目前認(rèn)為，miR－145作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等相關(guān)基因，從而影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)將慢病毒介導(dǎo)miR－145過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG－63細(xì)胞，觀察miR－145對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為（如侵襲和遷移力）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨肉瘤MG－63細(xì)胞株由華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)提供；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；miR－145熒光素酶檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）；Trizol及PCR試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；VEGF抗體（英國(guó)Abcam公司）；Matrigel（美國(guó)BD公司）；Transwell小室（以色列BI公司）；激光共聚焦顯微鏡（JSM－6030LV，日本電子株式會(huì)）。慢病毒載體由上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，序列如下：

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)信息預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建 利用生物學(xué)信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站（www.mirbase.org）對(duì)miR－145靶向結(jié)合VEGF－3′UTR區(qū)的位點(diǎn)進(jìn)行分析，可預(yù)測(cè)VEGF為miR－145的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告載體由上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列相符，所含目的基因序列準(zhǔn)確，說(shuō)明成功構(gòu)建報(bào)告基因載體。

1.2.2 骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%FBS、1%雙抗（100μg／mL青霉素和10μg／mL鏈霉素）、90%RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)骨肉瘤MG－63，置于培養(yǎng)箱（37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度條件）中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)1～2d生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)消化傳代。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化調(diào)整細(xì)胞密度為2×105mL－1接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為：轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miR－145陽(yáng)性序列）、對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列）、空白組（PBS）。以感染復(fù)數(shù)（muhiplieity of infection，MOI）為100，操作步驟參照試劑公司提供的轉(zhuǎn)染說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染4～6h更換培養(yǎng)液，48h后采用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率。

1.2.4 雙熒光素酶活性測(cè)定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，PBS洗滌，裂解液裂解細(xì)胞15min，4℃，13 000r／min離心10min，取5μL上清液與螢火蟲熒光素酶緩沖液及5μL底物，加入100μL反應(yīng)終止液，輕輕混勻，放入熒光發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，加入海腎熒光素酶反應(yīng)緩沖液及腔腸素底物5μL，再次加入100μL反應(yīng)終止液，輕輕混勻，再次放入熒光發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定海腎熒光素酶活性。每個(gè)樣品處理一致，比較海腎熒光素酶活性。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real－time PCR）檢測(cè)基因表達(dá) 常規(guī)消化各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，參照Trizol說(shuō)明書一步法提取各組細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA總純度和濃度，符合實(shí)驗(yàn)要求后，取2μL總RNA樣品，加入 M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取1μL的cDNA為模板，依次加入各引物序列行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性35min→93℃變性30s→57℃退火20s→76℃延伸5min，40個(gè)循環(huán)后，75℃終末延伸15min，進(jìn)行 Real－time PCR 結(jié)果分析。

1.2.6 Western－blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 參照文獻(xiàn)［5］的操作方法，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，滴加150μL一抗 VEGF及一抗β－actin（1∶2 000），4℃過(guò)夜；TBST洗膜；滴加100μL相應(yīng)二抗，37℃孵育1.5h；TBST洗膜，ECL顯色，掃描儀掃描條帶，Image J軟件分析光密度值。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 參照文獻(xiàn)［5］的操作方法，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取平均值，評(píng)估細(xì)胞侵襲能力。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力 參照文獻(xiàn)［5］的操作方法，按12，48h時(shí)間點(diǎn)取樣，拍照，并測(cè)量多個(gè)點(diǎn)劃痕寬度，采用Image J軟件分析計(jì)算平均劃痕愈合率。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)慢病毒載體攜帶最強(qiáng)紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）判 斷 轉(zhuǎn) 染 率，轉(zhuǎn) 染 率＞95%（圖1）。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率（熒光 ×400）Fig 1 Transfection efficiency was observed by laser confocal microscopy（Fluorescent ×400）

2.2 miR－145靶基因VEGF 計(jì)算熒光素酶活性（海腎熒光素酶／螢火蟲熒光素酶）比值（R／F），活性倍數(shù)為樣品的R／F與對(duì)照組的R／F的比值。將對(duì)照組熒光素酶活性分析的數(shù)值設(shè)定為1，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性比值分別為（1.00±0.52）和（0.47±0.34），與對(duì)照組比較，miR－145與 VEGF共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性明顯下降，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 miR－145和 VEGF的 mRNA 表達(dá) 各組miR－145和VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量見表1。與空白組和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組miR－145mRNA表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），而 VEGF mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；空白組和對(duì)照組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 Real－time PCR檢測(cè) miR－145和 VEGF的 mRNA表達(dá)Tab 1 The mRNA expression of miR－145and VEGF was detected by Real－time PCR

2.4 VEGF蛋白表達(dá) 空白組、對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白的相對(duì)光密度值（IOD）分別為（0.765±0.037），（0.623±0.028）及（0.083±0.030），與空白組和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組的VEGF蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；而空白組和對(duì)照組間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 Western－blot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)Fig 2 The VEGF protein expression was detected by Western－blot

2.5 細(xì)胞侵襲能力 空白組、對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì) 胞 數(shù) 分 別 為 每 個(gè) 視 野 （85.42±7.20），（86.69±6.48）及（43.65±4.36）個(gè)，與空白組和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；而空白組和對(duì)照組間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力（H－E染色 ×100）Fig 3 The cell invasiveness was detected by Transwell chamber assay（H－E ×100）

2.6 細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力 各組細(xì)胞劃痕遷移愈合情況見圖4?？瞻捉M、對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組的劃痕愈合率分別為（45.60±3.86）%，（43.23±2.78）%及（20.74±2.15）%，與空白組和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05）；而空白組和對(duì)照組間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

骨肉瘤惡性程度甚高，治療效果不佳，預(yù)后極差，早期即可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此，積極探索預(yù)防骨肉瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的新治療方法，已成為迫切需要解決的問(wèn)題。近年來(lái)，腫瘤基因治療已成為骨肉瘤研究中的熱點(diǎn)［6］。miR是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式致使mRNA靶目標(biāo)降解或抑制蛋白翻譯，以調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7－8］。miR－145是 miR 家 族的重要成員之一，一種腫瘤抑制基因，在多種腫瘤組織中表達(dá)降低［9］。miR－145可能是腫瘤抑制基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子，其在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其機(jī)制可能與編碼 miR－145基因位于脆性位點(diǎn)有關(guān)［10－11］。

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力（H－E染色×40）Fig 4 The cell migration motility was detected by cell scratch test（H－E ×40）

惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與腫瘤微血管的形成息息相關(guān)，而腫瘤微血管的形成與VEGF密切相關(guān)。VEGF是目前作用最強(qiáng)的促血管生成因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及血管構(gòu)建的作用［12］。大量研究證實(shí)，VEGF在多種腫瘤組織呈高表達(dá)，其誘導(dǎo)新生微血管形成，血管內(nèi)膜通透性較大，易于癌細(xì)胞侵入血管而發(fā)生轉(zhuǎn)移，而新生微血管形成也 是 轉(zhuǎn) 移 灶 生 長(zhǎng) 的 必 要 條 件［［13－14］。同 樣，VEGF在骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中也起著十分關(guān)鍵的作用，可以促進(jìn)骨肉瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［15］。同時(shí)miR－145也與血管內(nèi)膜的異常增殖相關(guān)。因此，有研究認(rèn)為，VEGF是miR－145的靶基因之一。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)miR－145過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤MG－63細(xì)胞，以觀察和研究miR－145對(duì)于人骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為（如侵襲和遷移力）的影響。首先利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF為miR－145的候選靶基因，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性明顯下降，驗(yàn)證了miR－145對(duì)靶基因VEGF的直接調(diào)控作用；同時(shí)，轉(zhuǎn)染組miR－145基因表達(dá)顯著增加，而VEGF基因和蛋白的表達(dá)顯著減少；轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞劃痕愈合率均顯著降低。說(shuō)明miR－145通過(guò)靶向抑制VEGF基因，進(jìn)而抑制成骨肉瘤MG－63細(xì)胞的侵襲及遷移能力。同樣，前期研究通過(guò)慢病毒攜帶miR－143過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨肉瘤143B細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR－143過(guò)表達(dá)可抑制成骨肉瘤143B細(xì)胞的侵襲及遷移能力［5］。范磊等采用脂質(zhì)體法將miR－145真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人骨肉瘤MG－63細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR－145可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。

綜上所述，VEGF是miR－145的靶基因之一，miR－145可通過(guò)直接或間接抑制VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步影響骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但是骨肉瘤的形成是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，miR－145的靶基因很多，目前許多研究仍然處于基礎(chǔ)探索研究階段，有待于今后進(jìn)一步研究。今后應(yīng)從動(dòng)物水平開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)治療性研究，將miRNA作為臨床治療的靶基因和新藥研發(fā)的作用靶點(diǎn)，有望為腫瘤治療提供一種新手段。