陳玉玲，許雄程，陽 雪，吳玉銘，何夢嬌，3，駱 凱，3

正畸治療涉及牙槽骨的骨改建。在壓力側(cè)，多核破骨細胞數(shù)量增加，出現(xiàn)骨吸收陷窩，牙槽骨將被吸收；而在張力側(cè)，成骨細胞功能活躍，表現(xiàn)為新生骨組織的形成［1］。近年來，骨改建中血管生成的意義越來越受學(xué)者們的重視。已有研究證實，血管生成和骨改建共同進行并相互影響，新生血管可加速新骨的形成，在骨改建過程中發(fā)揮重要作用［2－3］。成骨細胞作為骨改建過程中的重要細胞，不僅是骨組織礦化的主要細胞，還可調(diào)控骨組織的血管化［4－5］。本研究擬通過體外培養(yǎng)大鼠頜骨成骨細胞，初步探討體外培養(yǎng)過程中頜骨成骨細胞的成骨及成血管相關(guān)細胞因子的表達情況，為深入研究頜面部骨改建過程中成骨細胞對血管內(nèi)皮細胞的調(diào)控機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（100±20）g［福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SYXK（閩）2012－0001］。

1.1.2 試劑 DMEM 低糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清 （fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Hyclone公司）；膠原酶、抗壞血酸、β－甘油磷酸鈉、茜素紅S、地塞米松（美國Sigma公司）；鏈霉素、青霉素、堿性磷酸酶檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Trizol?Reagent（美國 Life Technologies公司）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；大鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），血管生成素－1（angiopoiettin－1，Angpt－1），成纖維生長因子－2（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF－2）酶聯(lián)免疫吸附 檢 測 試 劑 盒 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

1.1.3 儀器 細胞培養(yǎng)箱（HF240型）、生物安全柜（7BZ－ZHF1200A2）［中國力新儀器（上海）有限公司］；超凈工作臺（SW－CJ－1B，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；倒置熒光相差顯微鏡（IX－71，日本Olympus公司）；實時熒光定量 PCR儀（LightCycler 480，德國Roche公司）；高速離心機（SABOFUGE400R，德國Heraeus公 司）；酶 標 儀 （BIO－RADiMark，美 國Bio－Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠頜骨成骨細胞分離培養(yǎng) 參照文獻［6］的方法，大鼠經(jīng)腹腔注射100mg／kg氯胺酮麻醉處死，分離下頜骨獲取皮質(zhì)骨，經(jīng)PBS反復(fù)清洗后修整成1～2mm大小骨塊。37℃下胰蛋白酶（0.25%）孵育10min，膠原酶（0.1%）消化30min。棄上清，繼續(xù)消化1h，收集上清液，離心后棄上清。經(jīng)DMEM低糖培養(yǎng)液（含10%FBS、100U／mL青霉素、100U／mL鏈霉素）重懸后接種于培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。原代細胞90%融合后進行消化傳代。選擇P3以內(nèi)細胞進行實驗。

1.2.2 大鼠頜骨成骨細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色 大鼠頜骨成骨細胞接種于24孔板內(nèi)，接種密度為每孔2×104個。細胞接種1d后更換為成骨誘導(dǎo)液（50mg／mL抗壞血酸、10mmol／L地塞米松和2mmol／Lβ－甘油磷酸鈉）。誘導(dǎo)培養(yǎng)7d，用95%乙醇固定后進行ALP染色。

1.2.3 大鼠頜骨成骨細胞礦化結(jié)節(jié)檢測 大鼠頜骨成骨細胞接種于6孔板內(nèi)，接種密度為每孔1×105個。細胞接種1d后更換成骨誘導(dǎo)液，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后進行茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)。

1.2.4 大鼠頜骨成骨細胞成骨及成血管相關(guān)基因mRNA檢測 大鼠頜骨成骨細胞接種于6孔板內(nèi)，接種密度每孔1×105個。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3，7d后棄培養(yǎng)液，參照Trizol試劑盒說明提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按試劑盒說明書，實時熒光定量聚合 酶 鏈 反 應(yīng) （real－time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測 ALP，VEGF，F(xiàn)GF－2和Angpt－1Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt－related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、Ⅰ型膠原α1（collagen type I alpha 1，Col－Ⅰα1）的表達，以 GAPDH 為內(nèi)參，2－ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.5 大鼠頜骨成骨細胞成血管相關(guān)細胞因子的蛋白水平測定 大鼠頜骨成骨細胞接種于6孔板內(nèi)，接種密度為每孔1×105個。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3，7d后分別收集上清液。采用ELISA試劑盒檢測上清液中 VEGF，F(xiàn)GF－2和 Angpt－1的含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠頜骨成骨細胞原代培養(yǎng) 頜骨骨組織消化液接種24h后，可見個別散在細胞貼附于培養(yǎng)瓶底部。隨著培養(yǎng)時間的延長，貼壁細胞增多，細胞可為梭形、三角形或多邊形，可見圓形或卵圓形胞核（圖1A）。體外培養(yǎng)12d，細胞即可達90%融合進行傳代。選擇3代以內(nèi)的細胞進行實驗。

2.2 大鼠頜骨成骨細胞鑒定 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d，ALP染色可見體外培養(yǎng)的大鼠頜骨成骨細胞胞質(zhì)內(nèi)有棕黑色顆粒狀集簇（圖1B）。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d，細胞融匯成多層，重疊生長，局部聚集形成礦化結(jié)節(jié)。經(jīng)茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)可著色，呈橘紅色（圖1C）。

圖1 大鼠頜骨成骨細胞原代培養(yǎng)與鑒定Fig 1 Primary culture and identification of rat mandibular osteoblasts

2.3 成骨及成血管相關(guān)基因表達檢測 大鼠頜骨成骨細胞體外培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，成骨相關(guān)基因 ALP，RUNX2，OC和 Col－Iα1的 mRNA 表達水平均顯著增高（P＜0.05，圖2）。相應(yīng)的成血管相關(guān)基因 VEGF，F(xiàn)GF－2和 Angpt－1的 mRNA 表達也顯著增加（P＜0.05，圖3）。

圖2 大鼠頜骨成骨細胞成骨基因mRNA水平Fig 2 Expression of osteogenesis－related gene in rat mandibular osteoblasts

圖3 大鼠頜骨成骨細胞成血管相關(guān)基因mRNA水平Fig 3 Expression of angiogenesis－related gene in rat mandibular osteoblasts

2.4 成血管相關(guān)細胞因子的表達檢測 ELISA結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的大鼠頜骨成骨細胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞上清液中成血管相關(guān)細胞因子VEGF，F(xiàn)GF－2 和 Angpt－1 的 表 達 均 顯 著 增 加（P＜0.05，圖4）。

圖4 成血管相關(guān)細胞因子的含量Fig 4 Concentration of angiogenesis－related cytokines

3 討 論

骨改建涉及多細胞單位（basic multicellular unit，BMU）內(nèi)多種細胞間的相互作用和調(diào)控過程［7］。成骨細胞作為BMU中的主要功能細胞，其與血管內(nèi)皮細胞間的相互作用已成為學(xué)者們研究的重點［4－5，8］。本研究選擇體外培養(yǎng)早期的時間點初步探討頜骨成骨細胞分化過程中成血管相關(guān)因子表達的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的頜骨成骨細胞在成骨相關(guān)基因表達增加的同時，其成血管細胞因子VEGF，Angpt－1和FGF－2在mRNA及蛋白水平均顯著提高。該研究結(jié)果提示，成骨細胞在成骨分化早期，可通過分泌 VEGF，Angpt－1和FGF－2等細胞因子參與新骨形成過程的血管化調(diào)控。

目前用于研究成骨細胞生物學(xué)特性的細胞模型主要包括不同種屬來源的原代細胞和永生化或腫瘤細胞系［9］。大鼠成骨細胞由于體外培養(yǎng)容易、納入標準可控等特點，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準作為臨床前和臨床藥物療效評估模型，廣泛用于研究激素對細胞表型的影響及評估生物材料的安全性［10－11］。因此，本研究選擇大鼠頜骨作為研究對象，采用酶消化法獲取頜骨成骨細胞進行實驗。

ALP是公認的反映成骨細胞活性的生物標志物，在骨組織鈣化過程中發(fā)揮重要的作用［12－13］。實驗中對所培養(yǎng)的大鼠頜骨細胞進行ALP染色，可見細胞胞質(zhì)內(nèi)存在棕黑色顆粒，提示培養(yǎng)的成骨細胞具有ALP活性。此外，mRNA水平檢測也發(fā)現(xiàn)，細胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后，ALP的表達持續(xù)增加。體外礦化能力是成骨細胞的又一重要生物學(xué)特征［14］，實驗中體外培養(yǎng)的細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)連續(xù)培養(yǎng)后出現(xiàn)局部聚集，形成肉眼可見的礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈橘紅色。結(jié)合ALP檢測結(jié)果，證實所培養(yǎng)的為頜骨成骨細胞。

RUNX2是成骨細胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子，作為上游分子可啟動成骨分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中Ⅰ型膠原、OC等下游因子的表達，促進細胞的成骨分化，加速細胞外基質(zhì)沉積，最終形成骨組織［15］。本研究采用qPCR法對體外培養(yǎng)的大鼠頜骨成骨細胞的RUNX2，Col－Iα1，OC等基因表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長，體外培養(yǎng)的頜骨成骨細胞的RUNX2，Col－Iα1和 OC mRNA 表達水平均顯著增高，提示所培養(yǎng)的頜骨成骨細胞具有較好的成骨能力。

VEGF在血管生成和新骨形成中扮演十分重要的角色，通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的增殖，增加毛細血管滲透性，為血管內(nèi)皮細胞的遷移及血管形成提供條件［16］。Angpt－1具有穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞的作用，在促進血管分支形成過程中發(fā)揮重要作用［17］。FGF－2不僅可促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，還參與調(diào)控血管側(cè)支循環(huán)的形成［18］。已有報道顯示，在成骨分化早期，成血管因子的表達較低，成骨細胞可通過釋放成血管相關(guān)因子如VEGF等作用于血管內(nèi)皮細胞上的受體以促進血管化。新生血管不僅可為骨組織的形成輸送所需的氧氣和營養(yǎng)成分，同時血管內(nèi)皮細胞還可釋放成骨相關(guān)因子，如骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）－2 或 BMP－4等，以加速成骨細胞的分化成熟。隨著成骨細胞的分化成熟，成血管因子水平逐漸增高，并在成骨分化后期達到高峰，以后逐漸下降至生理水平［4，19］。本研究在檢測體外培養(yǎng)頜骨成骨細胞成骨分化能力的同時，采用qPCR及ELISA法分析了大鼠頜骨成骨細胞成血管相關(guān)細胞因子 VEGF，Angpt－1和FGF－2的mRNA和蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的大鼠頜骨成骨細胞在高表達成骨相關(guān)基因ALP，RUNX2，Col－Iα1和 OC的同時，還高表達成血管相關(guān)細胞因子。本研究結(jié)果提示，在骨改建過程中，頜骨成骨細胞不僅參與新骨的礦化成熟，還可通過分泌成血管細胞因子影響新骨的血管化。

盡管研究發(fā)現(xiàn)在本實驗條件下大鼠頜骨成骨細胞在成骨分化早期成骨相關(guān)基因表達增加的同時，其成血管細胞因子在mRNA及蛋白水平均相應(yīng)顯著增高，但上述成血管細胞因子對血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管形成過程的具體作用尚有待后續(xù)實驗探討。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，疾病狀態(tài)下如骨質(zhì)疏松，骨髓基質(zhì)細胞的成骨分化能力存在異常［20］?？紤]到成骨細胞主要來源于骨髓基質(zhì)細胞，骨質(zhì)疏松狀態(tài)下成骨細胞在骨組織形成過程的血管化調(diào)控能力的變化也是未來研究的方向。