劉鴻雁　吳晶　劉麗娜

摘要：目的 建立金桑芪抗毒滴丸HPLC特征指紋圖譜，對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。方法 采用Waters XSELECT CSH-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蘆丁、甘草苷、金絲桃苷、槲皮素和甘草酸銨為參照物，對(duì)10批金桑芪抗毒滴丸進(jìn)行相似度分析。結(jié)果 金桑芪滴丸特征圖譜共有24個(gè)共有峰，比對(duì)出了貫葉連翹、桑白皮、黃芪和甘草的特征峰，各批樣品的相似度均在0.9以上。結(jié)論 采用HPLC特征圖譜可對(duì)金桑芪抗毒滴丸實(shí)現(xiàn)全面和整體的評(píng)價(jià)，為有效提高該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：金桑芪抗毒滴丸；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；蘆丁；甘草苷；金絲桃苷；槲皮素；甘草酸銨；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.022

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）06-0090-05

Research on HPLC Fingerprint of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills

LIU Hong-yan1， WU Jing2，3， LIU Li-Na1， JIA Zhong1，2

1. Lanzhou Pulmonary Hospital， Lanzhou 730046， China； 2. Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；

3. Lanzhou City Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730050， China

Abstract： Objective To establish fingerprint of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills by HPLC； To control the quality of the preparation. Methods Waters XSELECT CSH-C18 chromatographic column （4.6 mm × 150 mm， 5 μm） was used and eluted with acetonitrile - 0.1% phosphoric acid solution gradient at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 260 nm with column temperature of 30 ℃. Using calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， rutin， liquiritin， hyperoside， quercetin and ammonium glycyrrhizinate as the object references， ten batches of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills were tested and analyzed by similarity comparison. Results Fringerprint spectrum of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills had 24 common peaks in total， and characteristic spectrums of Hypericum Perforatum， Mori Cortex， Astragali Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma had been found， while similarity of HPLC fingerprint was more than 0.9 among those batches of samples. Conclusion Using HPLC fingerprint can evaluate the Jinsangqi Kangdu Dropping Pills quality totality， which can provide references for improving the quality control of the preparation.

Keywords： Jinsangqi Kangdu Dropping Pills； calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside； rutin； liquiritin； hyperoside； quercetin； ammonium glycyrrhizinate； HPLC

金桑芪抗毒滴丸組方源于蘭州市肺科醫(yī)院感染科的驗(yàn)方，是在繼承前賢經(jīng)典方藥的基礎(chǔ)上，根據(jù)艾滋病的發(fā)病原因和致病機(jī)理，遵循中醫(yī)理法和組方原則，參考現(xiàn)代中藥研究成果，篩選組合而成。該方長(zhǎng)期作為艾滋病患者的輔助用藥，具有一定的臨床療效。方中貫葉連翹和桑白皮的活性成分具有抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒的作用[1-4]，黃芪可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力[5]，對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)均具有正向調(diào)節(jié)和保護(hù)修復(fù)作用。為更好地控制生產(chǎn)工藝、確保臨床療效，本研究旨在對(duì)金桑芪抗毒滴丸原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升，采用HPLC建立金桑芪抗毒滴丸活性組分的指紋特征圖譜分析方法[6-7]。通過(guò)對(duì)特征圖譜的特征峰數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度計(jì)算，對(duì)金桑芪抗毒滴丸活性組分的特征圖譜與原料藥特征圖譜的相關(guān)性進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)不同批次金桑芪抗毒滴丸樣品間的質(zhì)量差異。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters 2695，美國(guó)），PDA檢測(cè)器（Waters 2998）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)111920- 201505）、蘆?。ㄅ?hào)100080-201409）、甘草苷（批號(hào)111610-201607）、金絲桃苷（批號(hào)111521-201507）、槲皮素（批號(hào)100081-201509）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201619），中國(guó)食品藥品檢定研究院；金桑芪抗毒滴丸（批號(hào)分別為20161014、20161028、20161108、20161124、20161212、20161228、20170110、20170124、20170217、20170314），蘭州市肺科醫(yī)院制劑室。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters XSELECT CSH-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，流動(dòng)相為乙腈（A）-

0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，15%～43%A；20～38 min，43%～80%A；38～40 min，80%A），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品研細(xì)，取約5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇30 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）20 min，取出，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2 陰性對(duì)照溶液的制備

按金桑芪抗毒滴丸處方分別制備不含貫葉連翹、桑白皮、黃芪、甘草提取物的陰性樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蘆丁、甘草苷、金絲桃苷、槲皮素、甘草酸銨適量，分別用70%乙醇溶解，配成濃度分別為0.049 4、1.273、1.970、0.100、1.190、0.198 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。分別吸取各對(duì)照品溶液1000、100、200、1300、60、1000 ?L置于5 mL量瓶中，以70%乙醇定容，搖勻，得濃度分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.011 88 mg/mL、蘆丁0.025 46 mg/mL、甘草苷0.078 8 mg/mL、金絲桃苷0.026 0 mg/mL、槲皮素0.014 28 mg/mL、甘草酸銨0.039 6 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批號(hào)金桑芪抗毒滴丸供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以金絲桃苷作為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.038%～0.131%，相對(duì)峰面積的RSD為1.143%～1.672%，表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)金桑芪抗毒滴丸樣品5份，每份5.0 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.066%～0.471%，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為1.212%～1.825%，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取金桑芪抗毒滴丸同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.083%～1.238%，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為1.463%～2.167%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

2.4.1 指紋圖譜的建立

取10批金桑芪抗毒滴丸樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得到10批金桑芪抗毒滴丸HPLC指紋圖譜（見(jiàn)圖1）。確定了24個(gè)共有峰，且共有峰的總面積占總峰面積的90%，因此確定該24個(gè)色譜峰為金桑芪抗毒滴丸的指紋圖譜共有峰。

以5號(hào)峰（金絲桃苷）為參照峰，計(jì)算10批金桑芪抗毒滴丸樣品指紋圖譜各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1、表2?？梢?jiàn)，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，說(shuō)明該10批金桑芪抗毒滴丸樣品的成分及各成分含量均較為穩(wěn)定。

2.4.2 各共有峰的指認(rèn)

分別精密吸取金桑芪抗毒滴丸供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，10批樣品特征圖譜的色譜峰均在40 min內(nèi)全部出完，對(duì)所得特征圖譜進(jìn)行指認(rèn)，選擇穩(wěn)定性好、吸收強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定了24個(gè)峰（見(jiàn)圖2）。其中2、3、4、5、13、19號(hào)峰分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蘆丁、甘草苷、金絲桃苷、槲皮素和甘草酸銨峰。

通過(guò)對(duì)金桑芪抗毒滴丸供試品溶液圖譜和貫葉連翹、桑白皮、黃芪、甘草陰性對(duì)照溶液圖譜進(jìn)行比較分析，確定各特征峰的藥材歸屬。根據(jù)各共有峰的保留時(shí)間及紫外光譜信息，確認(rèn)了23個(gè)特征峰的來(lái)源，其中1個(gè)峰未得到歸屬。在特征圖譜的24個(gè)共有峰中，1、3、5、8、9、13號(hào)峰為貫葉連翹提取物中成分，其中3號(hào)峰為蘆丁，5號(hào)峰為金絲桃苷，13號(hào)峰為槲皮素；6、11、16、21、22、23、24號(hào)峰為桑白皮提取物中成分；2、7、10、12、18號(hào)峰為黃芪提取物中成分，其中2號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷；4、14、15、17、19號(hào)峰為甘草提取物中成分，其中4號(hào)峰為甘草苷，19號(hào)峰為甘草酸銨；20號(hào)峰為貫葉連翹和甘草提取物成分的共有峰。

2.5 樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）》軟件計(jì)算得出10批金桑芪抗毒滴丸特征圖譜的相似度（見(jiàn)表3）。結(jié)果顯示，各批樣品相似度均大于0.95，且各色譜峰的保留時(shí)間匹配較好，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%。由此可知，各批次藥材共有物質(zhì)出峰時(shí)間大致相同，成分較穩(wěn)定，含量也基本穩(wěn)定。

3 討論

由于中藥復(fù)方具有成分復(fù)雜、有效成分不確定等因素，目前中藥制劑的含量測(cè)定指標(biāo)選擇一直難以統(tǒng)一。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立過(guò)程中，往往以含量高、易檢測(cè)但可能與制劑療效無(wú)關(guān)的化學(xué)成分作為檢測(cè)指標(biāo)。王翰華等[8]提出，在選擇含量測(cè)定指標(biāo)時(shí)應(yīng)綜合考慮各藥味所含的有效成分、特征成分、毒性成分等，建立多指標(biāo)含量測(cè)定體系。本試驗(yàn)是對(duì)金桑芪抗毒滴丸原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步提升，通過(guò)對(duì)比研究提取條件、色譜條件和檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)主要特征成分測(cè)定的影響，建立該制劑的HPLC特征指紋圖譜。

首先，試驗(yàn)比較了超聲提取和回流提取之間的差異，同時(shí)比較了不同濃度乙醇提?。?0%、50%、70%）和提取時(shí)間之間的差異。結(jié)果顯示，加熱回流提取和超聲提取的金絲桃苷含量相當(dāng)。考慮到超聲提取耗能低、簡(jiǎn)便易行，故采用超聲提取法。以金絲桃苷的含量為指標(biāo)，得到最佳提取條件為50%乙醇超聲提取20 min。

其次，在流動(dòng)相的選擇中，以金絲桃苷的含量為考察指標(biāo)，分別評(píng)價(jià)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行等度和梯度洗脫的效果。結(jié)果顯示，梯度洗脫以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相最優(yōu)，峰形、分離度均較好，各峰的保留時(shí)間適中，且分析時(shí)間適宜，均在40 min內(nèi)完成。

第三，對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷λmax為260 nm，蘆丁λmax為257 nm，甘草苷λmax為237 nm，金絲桃苷λmax為254 nm和357 nm，槲皮素λmax為257 nm，甘草酸銨λmax為237 nm。提取不同吸收波長(zhǎng)的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在260 nm波長(zhǎng)處各峰吸收均較好，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

本試驗(yàn)共考察了10批樣品共有峰的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，其RSD和非共有峰總面積占總峰面積比值均符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》[9]，故由此建立的指紋圖譜可以用于金桑芪抗毒滴丸的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-10-30）

（修回日期：2017-11-14；編輯：陳靜）