高永平， 馬艷梅， 李 娜

(信陽學(xué)院理工學(xué)院應(yīng)用生物化學(xué)研究所，河南信陽 464000)

新疆和田玫瑰花由于特殊的地理位置，人跡罕至，日照時間長，而且花期一年一次，再加之昆侖山雪水澆灌，是唯一達到國家有機無污染的純凈玫瑰。其天然的經(jīng)濟和觀賞價值，深得人們的接受和喜愛。尤其是經(jīng)濟價值，其花蕾為名貴中草藥材，具有排毒養(yǎng)顏、開竅化瘀、行氣活血、助消化、促進膽汁分泌、調(diào)節(jié)機體等之功效[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰花粉中富含多種脂肪酸，而脂肪酸是人體生理功能正常運行不可或缺的營養(yǎng)素，尤其是不飽和脂肪酸，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及視網(wǎng)膜的生長和發(fā)育等具有重要的作用，可預(yù)防和改善動脈硬化、抑郁癥、心臟病以及癌癥等功效[4-5]。所以，對玫瑰花粉中脂肪酸的定性定量研究非常重要。

圖1 BAETS的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of BAETS

截至目前，關(guān)于新疆和田玫瑰花中脂肪酸成分的研究報道甚少。本研究采用高靈敏的熒光試劑苯并[b]吖啶酮-5-乙基對甲苯磺酸酯(BAETS)[6]作為柱前衍生化試劑(結(jié)構(gòu)見圖1)，95 ℃下，在N，N-二甲基甲酰胺溶劑中，以K2CO3作催化劑可獲得穩(wěn)定的熒光產(chǎn)物。衍生條件溫和、實驗操作簡便、衍生脂產(chǎn)率高，可直接進樣而不需預(yù)處理。液相色譜使用三元梯度洗脫，使樣品中脂肪酸衍生物達到完全基線分離，實現(xiàn)了對玫瑰花粉中脂肪酸準(zhǔn)確、靈敏的定量測定。為進一步合理開發(fā)利用新疆和田玫瑰花粉提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 儀器、試劑與材料

采用大氣壓化學(xué)電離源(APCI source)，Agilent 1100離子阱，配備四元梯度泵高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)，配自動進樣器、在線真空脫氣機和熒光檢測器。

脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國，Sigma公司)、N,N-二甲基甲酰胺(色譜純)、乙腈(色譜純)、酒石酸鈉(分析純)、K2CO3(分析純)、檸檬酸鉀(分析純)、NaAc(分析純)、K2C2O4·H2O(分析純)。水由SZ-97A三重純水蒸餾器制備。

新疆和田玫瑰花粉。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品中脂肪酸的提取將樣品于50 ℃烘箱中烘干，稱取0.1595 g于10 mL容量瓶中，然后加入10 mL氯仿浸泡5 min，超聲20 min，靜置12 h，2 mL氯仿潤洗，合并濾液，然后加1.5 mL吡啶超聲30 s，氮氣吹干溶劑，用500 μL N,N-二甲基甲酰胺定容，備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品衍生步驟將10 mg催化劑K2CO3，180 μL N,N-二甲基甲酰胺，50 μL脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，180 μL BAETS依次加入安培瓶后，密封，95 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)30 min，用300 μL乙腈稀釋100 μL衍生液，以10 μL為單位進樣。衍生反應(yīng)機理：脂肪酸的羰基碳進攻衍生試劑的羥基氧生成相應(yīng)的羧酸酯，從而完成衍生化反應(yīng),如圖2所示。

圖2 BAETS與脂肪酸的衍生反應(yīng)圖Fig.2 Derivatization scheme of BAETS with fatty acids

1.2.3脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制以乙腈作溶劑，配制濃度為2.0×10-2mol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，相應(yīng)低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋而成。稱取2.215 mg的BAETS，用N,N-二甲基甲酰胺配制成500 μL 1.0×10-2mol·L-1溶液。

1.2.4色譜及質(zhì)譜條件Hypersil BDS C8色譜柱(200×4.6 mm i.d.,5m)；柱溫30 ℃，控制流速為1.0 mL·min-1，以10 μL為單位進樣；流動相A：10%乙腈/水溶液(含30 mmol/L甲酸銨)，流動相B：50%乙腈+50%N,N-二甲基甲酰胺(體積比為1∶1)，流動相C：100%乙腈。最大激發(fā)波長：273 nm；最大發(fā)射波長：503 nm。正離子模式大氣壓化學(xué)電離源，干燥氣溫度：350 ℃，噴霧壓力：410 kPa，氣化溫度：450 ℃，干燥氣流量：5 L·min-1，電暈電流：4 000 nA(Pos)，毛細管電壓：3 500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生條件的優(yōu)化

BAETS與脂肪酸的衍生化產(chǎn)率隨試劑倍數(shù)(衍生試劑量與標(biāo)準(zhǔn)品量的比值)、催化劑、衍生時間、衍生溫度的不同有顯著的差異。本實驗隨機選取十二酸、十六酸、2,5,8,11,14,17-二十二碳八烯酸、6,9,12,15-二十碳四烯酸、9,12-十八碳二烯酸為研究對象，分別對以上影響因素進行優(yōu)化。結(jié)果表明，衍生化產(chǎn)率最優(yōu)條件：衍生時間30 min，衍生溫度為95 ℃，試劑倍數(shù)為6。在堿性催化劑的選擇上，分別選取K2CO3、檸檬酸甲、NaAc、酒石酸鈉、K2C2O4作為考察對象，結(jié)果表明：K2CO3效率最高。同時，實驗發(fā)現(xiàn)K2CO3用量越大，衍生化產(chǎn)率越高，但試劑的分解程度也會增加。綜合考慮，K2CO3的量選取10 mg。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC分離及MS鑒定

按照優(yōu)化條件，對脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品進行衍生化并進樣定性定量鑒定。結(jié)果顯示：66 min內(nèi)可實現(xiàn)34種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的基線分離(圖3)，以十六脂肪酸衍生物為代表的質(zhì)譜圖如圖4所示。

2.3 線性回歸方程，檢出限和重現(xiàn)性

在相同洗脫條件下，進樣量范圍：0.0975l～50 pmol，各脂肪酸衍生物的回歸方程、檢出限和相關(guān)系數(shù)，按照峰面積(y)、實際進樣量(x)進行線性回歸，其中對標(biāo)準(zhǔn)系列溶液平行6次分析，得到表1相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示：各脂肪酸衍生物的線性相關(guān)系數(shù)在0.9917～0.9999范圍，檢出限(信噪比S/N=3)范圍為11.71～68.26 fmol，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<2.2350%，保留時間的RSD<0.4476%。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸衍生物總離子流(TIC)色譜圖Fig.3 TIC chromatograms for standard fatty acid derivatives from 34 fatty acid standardsPeak lables:C4(butyric acid);C5(valeric acid)；C6(hexanoic acid);C7(heptoic acid);C8(octoic acid);C9(pelargoic acid);C10(decoic acid);C11(undecanoic acid);C12(dodecanoic acid);C20:5(5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid);C13(tridecanoic acid);C18:3(8,11,14-octadecatrienoic acid);C22:6(2,5,8,11,14,17-docosahexenoic acid);C14(tetradecanoic acid);C20:4(6,9,12,15-arachidonic acid);C18:2(9,12-octadecadienoic acid);C15(pentadecanoic acid);C16(hexadecanoic acid);C18:1(12-octadecenoic acid);C17(heptadecanoic acid);C18(octadecanoic acid);C20:1(11-eicosenoic acid);C19(nonadecanoic acid);C20(eicosoic acid);C21(heneicosoic acid);C22(docosanoic acid);C23(tricosanoic acid);C24(tetracosanoic acid);C25(pentacosanoic acid);C26(hexacosanoic acid);C27(heptacosanoic acid);C28(octacosanoic acid);C29(nonacosanoic acid);C30(dotriacontanoic acid).

圖4 十六脂肪酸衍生物質(zhì)譜圖Fig.4 MS and MS/MS spectra of representative hexadecanoic acid derivative

2.4 脂肪酸回收率和實際樣品含量

樣品按照實驗方法提取脂肪酸并進行衍生，得到新疆和田玫瑰花樣品中各脂肪酸的回收率范圍為97.93%～101.30%。在相同的實驗條件下，得到玫瑰花粉樣品中脂肪酸總離子流色譜圖(圖5)以及各脂肪酸的測定結(jié)果(表2)。

圖5 玫瑰花粉樣品中脂肪酸總離子流(TIC)色譜圖Fig.5 TIC chromatogram of fatty acid derivatives from rose pollen

Fatty acidLinear regression equationCorrelation coefficientDetection limit(fmol)RSD(%)Peak areaRetention time Butyric acidy=41.47x+11.330.999329.790.310.066Valeric acidy=53.44x+13.840.999632.770.420.044Hexanoic acidy=43.16x+10.830.999836.010.340.018Heptoic acidy=49.84x+10.050.999930.070.400.016Octoic acidy=42.01x+12.510.999640.960.240.016Pelargoic acidy=39.95x+5.860.999940.960.290.011Decoic acidy=44.61x+12.250.999938.100.360.011

(續(xù)表1)

Fatty acidLinear regression equationCorrelation coefficientDetection limit(fmol)RSD(%)Peak areaRetention time Undecanoic acidy=39.72x+7.820.999968.260.210.019Dodecanoic acidy=43.44x+16.220.999540.970.200.0225,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acidy=34.35x+9.060.999840.960.260.032Tridecanoic acidy=44.11x+15.230.999536.410.220.0308,11,14-Octadecatrienoic acidy=61.85x+24.050.999718.210.230.0362,5,8,11,14,17-Docosahexenoic acidy=37.63x+6.530.999940.980.200.023Tetradecanoic acidy=34.55x+5.410.999954.620.260.0256,9,12,15-Arachidonic acidy=54.05x+12.600.999854.630.320.0439,12-Octadecadienoic acidy=48.74x+35.820.992732.770.230.050Pentadecanoic acidy=29.34x+8.320.999754.610.290.031Hexadecanoic acidy=54.02x+41.480.991611.710.220.03112-Octadecenoic acidy=90.22x+18.760.999925.210.300.034Heptadecanoic acidy=46.30x+9.210.999940.950.270.044Octadecanoic acidy=41.83x+9.050.999938.100.150.04311-Eicosenoic acidy=51.35x+12.100.999936.420.200.030Nonadecanoic acidy=47.76x+9.080.999936.440.140.052Eicosoic acidy=33.56x+1.700.999836.430.380.042Heneicosoic acidy=59.65x+15.830.999727.340.320.061Docosanoic acidy=113.90x+25.530.999823.440.420.036Tricosanoic acidy=57.79x+13.120.999925.220.280.038Tetracosanoic acidy=62.43x+12.950.999932.770.320.044Pentacosanoic acidy=57.54x+9.350.999940.950.280.039Hexacosanoic acidy=54.76x+13.030.999936.420.160.028Heptacosanoic acidy=56.89x+2.730.999740.960.280.062Octacosanoic acidy=56.16x+14.590.999836.430.230.033Nonacosanoic acidy=48.39x+12.000.999836.410.280.034Dotriacontanoic acidy=37.94x+12.940.999746.810.220.043

表2 實際樣品脂肪酸含量測定結(jié)果

*Not detected.

3 結(jié)論

本實驗以自制熒光探針BAETS作為柱前衍生試劑，采用HPLC-MS技術(shù)，通過對衍生以及色譜條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了34種脂肪酸的基線分離，并對新疆和田玫瑰花粉中脂肪酸的含量進行了測定。結(jié)果表明，新疆和田玫瑰花粉中富含飽和及不飽和脂肪酸，尤其以己酸、辛酸、十六酸、二十酸、8,11,14-十八碳三烯酸及9,12-十八碳二烯酸的含量較為突出。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。為新疆和田地區(qū)玫瑰花特色產(chǎn)品的研究以及開發(fā)利用提供有益參考。