晉曉勇， 張慧佳， 官菊芳， 彭 娟

(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川 750021)

納米材料因其具有獨(dú)特的物理化學(xué)、光學(xué)及電學(xué)性質(zhì)而備受關(guān)注[1 - 2]。貴金屬納米簇在生物成像[3]、催化[4]及化學(xué)傳感器[5]方面的應(yīng)用十分廣泛。金納米簇(AuNCs)由于其相對(duì)簡便的制備方法，超小的尺寸，較強(qiáng)的熒光和生物相容性以及高穩(wěn)定性成為主要關(guān)注對(duì)象。合成熒光AuNCs的方法中一般都使用具有生物相容性的還原劑或者穩(wěn)定劑，比如蛋白質(zhì)和多肽，其中包含硫醇、氨基及羧基，具有高度親和力，可以將金離子還原成原子[6]。蛋白質(zhì)在合成AuNCs的過程中也具有舉足輕重的地位[7]。到目前為止，多種蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)[8]、胰島素[9]、辣根過氧化物酶[10]、胃蛋白酶[11]、乳鐵蛋白[12]及溶菌酶[13]等都被當(dāng)作模板用來合成AuNCs。為了得到具有較強(qiáng)熒光的納米簇，一般都在相對(duì)較高的pH和溫度下來制備，但這會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去生物活性。因此，尋找一種簡便并具有強(qiáng)烈熒光及高穩(wěn)定性的AuNCs合成方法是當(dāng)務(wù)之急。

本文采用水熱法制備了以膽酸鈉為穩(wěn)定劑與還原劑的具有強(qiáng)烈藍(lán)色熒光的AuNCs。膽酸鈉是一種表面生物活性劑，它具有部分親水及部分親油性、化學(xué)性質(zhì)不同的官能團(tuán)、結(jié)構(gòu)鋼性、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，因此膽酸鈉是制備AuNCs的理想模板。AuNCs的平均直徑為4.2 nm，能發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光，穩(wěn)定性高。采用AuNCs的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象來檢測乳制品中的三聚氰胺，AuNCs的熒光強(qiáng)度與三聚氰胺的濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，并呈現(xiàn)出較寬的檢測范圍與較低的檢測限。熒光光度法檢測乳制品中的三聚氰胺是一種簡便、快速、靈敏度很高的檢測方法，在實(shí)時(shí)檢測應(yīng)用中也具有較大潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與條件

JEOLJEM-2010型高倍透射電子顯微鏡(日本，JEOL公司)，加速電壓300 kV。將粉末樣品放入無水乙醇中，超聲分散后滴至微柵上；Rigaku D/Max 2550型X射線粉末衍射儀(日本，日立公司)，Cu靶，λ=0.154 nm，電壓為50 kV，管電流200 mA，掃描速度10°/min；TENSOR-27型傅里葉變換紅外光譜儀(德國，布魯克公司)，測試時(shí)光譜純KBr作為背底；F-7000熒光分光光度計(jì)(日立,高新技術(shù)有限公司)，激發(fā)光的狹縫寬度為5 nm，發(fā)射光的狹縫寬度為10 nm，掃描電壓為400 V。

1.2 試劑

HAuCl4·4H2O、三聚氰胺、膽酸鈉(NaC)，均購買于阿拉丁試劑公司。試劑均為分析純。不同濃度的三聚氰胺用40.0 mmol/L的B-R緩沖溶液(pH=7.0)配制。實(shí)驗(yàn)用水為艾柯實(shí)驗(yàn)室專用超純水。

1.3 AuNCs的合成

將11.6 mL 1.0% HAuCl4水溶液與8.0 mL的0.0092 g·mL-1NaC水溶液混合，攪拌均勻后，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為12.0，持續(xù)攪拌10 min，在180 ℃反應(yīng)8 h，得AuNCs分散液。

1.4 三聚氰胺的測定

50.0 μL AuNCs與不同濃度的三聚氰胺溶液混合，攪拌均勻，用pH=7.0的40.0×10-3mol/L B-R緩沖溶液定容至3.0 mL，反應(yīng)40 min后測量熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長：365 nm，發(fā)射波長：390～800 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNCs的表征

從圖1(A)的AuNCs透射電鏡(TEM)照片中可看出，合成的AuNCs其分散性好且無任何粘著團(tuán)聚現(xiàn)象，顆粒大小均一，其平均粒徑為4.2 nm(圖1(B))。圖1(C)為NaC與AuNCs的X射線衍射(XRD)圖的對(duì)比圖。圖中曲線a為NaC在17.0°對(duì)應(yīng)一個(gè)衍射峰，而在曲線b中也可以看到，由此判斷當(dāng)以NaC為模板制備AuNCs時(shí)，NaC起到良好的模板作用，且其晶體結(jié)構(gòu)與金的面心立方結(jié)構(gòu)是吻合的。圖1(D) 為NaC與AuNCs的紅外(IR)光譜圖。NaC的特征峰在3 420 cm-1(υO(shè)-H)和1 620 cm-1(υC=O)，從曲線b中可以看出AuNCs與NaC的圖譜相似，可以觀察到O-H與C=O對(duì)應(yīng)的3 450 cm-1和1 662 cm-1。這就很好的證明AuNCs的表面含有-OH和-COOH官能團(tuán)，而且在以NaC為模板制備AuNCs時(shí)，NaC通過共價(jià)鍵結(jié)合在AuNCs表面。

圖1 (A)AuNCs的透射電鏡(TEM)圖(插圖為高分辨電鏡圖)；(B)AuNCs的尺寸分布圖；(C)NaC和AuNCs的X射線衍射(XRD)圖；(D)NaC和AuNCs的紅外(IR)光譜圖Fig.1 (A)TEM image of AuNCs(Inset is the HRTEM image of AuNCs)；(B)Size distribution histogram of AuNCs；(C)XRD of sodium cholate and AuNCs；(D)IR spectra of sodium cholate(a) and AuNCs(b)

圖2A為在不同激發(fā)波長下AuNCs的發(fā)射光譜?？疾炝思ぐl(fā)波長在300～540 nm范圍內(nèi)AuNCs的熒光發(fā)射。由圖可知，隨著激發(fā)波長的逐漸增大，熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)激發(fā)波長為360 nm時(shí)，其熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，繼續(xù)增大激發(fā)波長時(shí)，其熒光強(qiáng)度則逐漸減弱。因此，360 nm為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中AuNCs的激發(fā)波長。與此同時(shí)，可觀察到熒光發(fā)射光譜隨著激發(fā)波長的逐漸增大發(fā)生紅移現(xiàn)象。圖2B為AuNCs的熒光激發(fā)與熒光發(fā)射光譜圖。激發(fā)波長為365 nm，而發(fā)射波長為481 nm，這也證實(shí)了在紫外燈照射下觀察到的AuNCs呈藍(lán)光。

圖2 (A)不同激發(fā)波長下AuNCs的熒光發(fā)射光譜圖；(B)AuNCs的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜圖Fig.2 (A) Fluorescence spectra of AuNCs at different excitation wavelengths (λex);(B) Fluorescence emission and excitation spectra of AuNCs

2.2 熒光增強(qiáng)現(xiàn)象

圖3 AuNCs體系中有無三聚氰胺的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of AuNCs(a) before and(b) after adding melamine.

從圖3可以看出，當(dāng)體系為AuNCs時(shí)，其熒光強(qiáng)度為圖中曲線a所示，而當(dāng)向體系中加入7.5×10-11mol/L的三聚氰胺時(shí)，其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(曲線b)。其主要的原理：當(dāng)向AuNCs溶液中加入三聚氰胺時(shí)，AuNCs會(huì)與三聚氰胺發(fā)生相互作用，即AuNCs表面包被NaC，說明AuNCs表面含有羧基官能團(tuán)，而羧基會(huì)與三聚氰胺的氨基形成氫鍵，從而改變其表面狀態(tài)，產(chǎn)生熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。

2.3 測定條件的優(yōu)化

考察了實(shí)驗(yàn)條件，如溶液的pH、溫度、AuNCs的用量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)三聚氰胺熒光檢測的影響。由圖4A可知，在pH范圍為3.0～11.0，隨著pH的逐漸增大，AuNCs-三聚氰胺體系的熒光強(qiáng)度呈增加趨勢，當(dāng)pH增大到7.0時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，再繼續(xù)增加體系pH時(shí)，熒光強(qiáng)度值趨于穩(wěn)定。

從圖4B可以看出，反應(yīng)時(shí)間為10～60 min，隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增加，AuNCs-三聚氰胺體系的熒光強(qiáng)度比值(F/F0)逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到40 min時(shí)，(F/F0)值處于緩慢增加的趨勢，再延長反應(yīng)時(shí)間到50甚至60 min時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度也沒有明顯增強(qiáng)。從圖4C中可以看出，隨著AuNCs的濃度逐漸增加時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度是逐漸增大的，即[(F-F0)/F0]值逐漸增大，當(dāng)AuNCs的濃度為0.16×10-3mol/L時(shí)，[(F-F0)/F0]值趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增大AuNCs的濃度對(duì)體系中熒光增強(qiáng)現(xiàn)象并無明顯影響。從圖4D可以看出，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，[(F-F0)/F0]值最大，隨著溫度增加到37 ℃和50 ℃時(shí)，AuNCs-三聚氰胺體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低，即[(F-F0)/F0]值逐漸減小。綜上所述，檢測三聚氰胺的最優(yōu)條件為：pH為7.0，反應(yīng)時(shí)間為40 min，AuNCs的濃度為0.16×10-3mol/L，反應(yīng)溫度為25 ℃。

圖4 pH值(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、AuNCs的量(C)和反應(yīng)溫度(D)對(duì)AuNCs三聚氰胺體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH(A)、reaction time(B),the amount of AuNCs(C) and reaction temperature(D) on the fluorescence intensity of AuNCs-melamine system

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

基于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的考察可知，AuNCs的熒光強(qiáng)度隨著三聚氰胺濃度對(duì)數(shù)的增加而增強(qiáng)。從三聚氰胺濃度的對(duì)數(shù)與[(F-F0)/F0]的工作曲線，得到線性回歸方程為：[(F-F0)/F0]=2.0220+0.0187logc，相關(guān)系數(shù)為0.9925，檢測限為2.30×10-9mol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道的三聚氰胺的檢測方法[15 - 20]比較，本文所建立的方法表現(xiàn)出更寬的線性范圍和更低的檢測限。

2.5 選擇性

2.6 實(shí)際樣品測定

在此基礎(chǔ)上，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了測定。選取超市售的三種牛奶(1#～3#) 與兩種奶粉(4#～5#)，其主要測定結(jié)果如表1所示。從結(jié)果可知，通過熒光光譜法檢測實(shí)際樣品中的三聚氰胺具有較高的重現(xiàn)性，因此這種簡便快捷的方法可以作為檢測乳制品中三聚氰胺的有效手段。

表1 牛奶與奶粉中三聚氰胺的測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

采用水熱法制備了較強(qiáng)藍(lán)色熒光性能和良好的水分散性的AuNCs。三聚氰胺的加入會(huì)產(chǎn)生AuNCs的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，基于該原理發(fā)展了一種熒光法來檢測三聚氰胺的含量。該方法具有檢測限低，檢測范圍寬及選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于乳制品中三聚氰胺的檢測。