張彩艷， 馮榮榮， 李曉霞

(延安大學化學與化工學院，陜西延安 716000)

卡那霉素(Kanamycin，KM) 是一種氨基糖苷類抗生素，因其價格低廉、抗菌性強，被廣泛用做獸藥。但若食用過量KM殘留的動物源性食品會導致耳毒性、腎毒性等副作用[1-3]。因此，建立快速、靈敏、低成本檢測食品中KM殘留的方法具有重要意義。目前報道KM的主要測定方法有色譜法[4-5]、色譜-質譜聯(lián)用法[6]、毛細管電泳法[7]、電化學法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]等。但這些方法存在儀器價格昂貴，檢測耗時，樣品的預處理步驟繁瑣等缺點。

金納米粒子(AuNPs)比色法是基于AuNPs表面等離子共振效應的光學檢測技術。與其他方法相比，可將分子識別轉換為顏色變化，通過肉眼進行判斷，進而通過儀器進一步定量分析測定。方法因原理簡單、無需大型儀器、操作成本低且便于直接觀測，被廣泛用來檢測DNA、金屬離子、蛋白質、陰離子和小分子等物質[10]。本文基于AuNPs比色法構建了兩種檢測KM的新方法。實驗發(fā)現(xiàn)直接加入KM可使AuNPs顏色發(fā)生變化，且紫外吸收波長紅移，吸光度降低。而采用核酸適配體AuNPs比色法測定，由于核酸適配體與KM結合，釋放出單鏈DNA吸附于AuNPs表面使其保持穩(wěn)定，顏色不發(fā)生變化。結果表明，方法一操作簡單，但選擇性較差。方法二檢測KM的線性范圍、檢出限和選擇性較方法一更好。兩種方法均可用于牛奶樣品中KM的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

8453型紫外可見分光光度計(美國,安捷倫公司)；LG10-2.4A高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；超純水機(四川優(yōu)普超純有限公司)。

卡那霉素適配體：5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA GTC AC-3′，部分互補DNA：5′-TAT GTG ACT CGG CTT-3′，硫酸卡那霉素(Kanamycin,KM)，硫酸慶大霉素(Gentamycin,GM)，鹽酸四環(huán)素(Tetracycline,TC)，硫酸新霉素(Neomycin,NM)和硫酸鏈霉素(Streptomycin,SM)，均購自上海生工生物工程股份有限公司。DNA序列在使用前要用超速離心機離心5 min，加水配成一定濃度的溶液， 4°C冰箱中保存待用。HAuCl4·4H2O購自國藥集團。所用其它試劑均為分析純。

伊利純牛奶購自本地超市。

1.2 實驗方法

AuNPs參考文獻報道方法[11]合成。

AuNPs比色法：將1 mL AuNPs與140 μL不同濃度KM溶液在室溫下反應70 min，觀察顏色變化并用紫外分光光度計分別測定 520 nm和 620 nm處的吸光度值。

核酸適配體AuNPs比色法：在50 μL 4 μmol/L部分互補單鏈DNA中，加入60 μL 4 μmol/L KM適配體，再加入90 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)，室溫下反應60 min。獲得1 μmol/L dsDNA溶液。將10 μL 1 μmol/L dsDNA與 10 μL未知濃度KM溶液，在室溫下反應40 min后，加入100 μL AuNPs在室溫下再反應10 min，最后加入5 μL 0.5 mol/L NaCl溶液，靜置12 min。測定520 nm處的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 AuNPs比色法測定卡那霉素

2.1.1實驗原理圖1A為AuNPs比色法檢測KM的原理圖，在酒紅色的AuNPs中加入不同濃度的KM，AuNPs顏色由酒紅色逐漸轉變?yōu)樗{色。原因是在含檸檬酸鹽的AuNPs溶液中，檸檬酸根陰離子會組裝于帶正電荷的AuNPs表面，使AuNPs成為帶負電荷的超分子化合物。未加KM，分散狀態(tài)下AuNPs呈酒紅色，粒徑約為13 nm。加入KM，荷負電AuNPs與質子化的KM陽離子因靜電引力和疏水作用力結合，形成粒徑更大的聚集體，平均粒徑從13 nm 增至20 nm，使AuNPs溶液顏色由酒紅色變?yōu)樽仙蛘咚{色。實驗對加入KM前后AuNPs溶液的吸收光譜進行了掃描，結果如圖1B所示， AuNPs的最大吸收波長為520 nm(曲線a)，根據(jù)吸光度計算得AuNPs的濃度為2.1×10-9mol/L(ε=4.2×108L/(mol·cm))。當加入3.0 μmol/L KM后，520 nm處的吸光度明顯降低，620 nm處吸光度增加(曲線b)。結果與文獻報道AuNPs在520 nm 處吸收峰的吸光度會降低，同時在620 nm左右產(chǎn)生團聚態(tài)AuNPs的共振吸收一致[12]。說明KM與AuNPs發(fā)生作用，可以用AuNPs比色法對KM進行測定。

圖1 AuNPs比色法檢測KM原理圖(A)及紫外-可見吸收光譜圖(B)Fig.1 Schematic diagram showing colorimetric detection of kanamycin using AuNPs (A) and absorption spectra of AuNPs and in presence of kanamycin (B)(a)AuNPs(cAuNPs=2.1×10-9 mol/L);(b)AuNPs+KM (cAuNPs=2.1×10-9 mol/L,cKM=3.0 μmol/L).

2.1.2實驗條件優(yōu)化分別考察了AuNPs與KM溶液的反應時間和KM溶液的體積對實驗的影響。結果發(fā)現(xiàn)，當AuNPs與KM溶液的反應時間到60 min 后，吸光度比值A620/A520基本恒定，故本實驗選擇最佳反應時間為70 min。當加入KM體積為120 μL時，A620/A520吸光度比值基本恒定。因此，KM溶液的體積為140 μL。

圖2 加入不同濃度KM后AuNPs-KM溶液的紫外-可見(UV-Vis)光譜和標準曲線Fig.2 UV-Vis spectra of AuNPs-KM after reaction with different concentrations of KM(Inset is the standard curve)a→f:0,0.1,1.0,2.0,3.0,4.0 μmol/L,respectivity.

2.1.3分析特性在優(yōu)化的實驗條件下，測定了不同濃度KM與AuNPs作用的吸光度值。由圖2可知，AuNPs的吸光度比值A620/A520與KM的濃度在0.1 ～ 4.0 μmol/L范圍內存在良好的線性關系，其線性方程為：A620/A520=0.1157c(μmol/L)+0.1699 (r=0.9935)，檢出限(S/N=3)為33 nmol/L。

2.1.4實際樣品分析牛奶樣品處理參照文獻方法[8]。將KM加入到處理好的牛奶樣品中，分別配制成含0.5、1.0、2.0 μmol/L KM的加標樣品，然后按照1.2節(jié)方法測其吸光度，根據(jù)標準曲線計算回收率。測定結果如表1。

2.1.5選擇性實驗分別測定了多種不同抗生素對檢測KM的影響。分別在AuNPs-3 μmol/L KM溶液里加入慶大霉素(GM)，新霉素(NM)，鏈霉素(SM)和四環(huán)素(TC)。結果如圖3所示，同倍的慶大霉素和新霉素，10倍的鏈霉素和100倍的四環(huán)素對測定有干擾。

2.2 核酸適配體AuNPs測定KM

2.2.1實驗原理為了提高測定方法的選擇性和靈敏度，本實驗采用核酸適配體AuNPs比色法對KM進行測定。實驗原理如圖4所示，當不含KM時，核酸適配體與互補鏈DNA形成穩(wěn)定的雙鏈，高濃度NaCl溶液導致AuNPs團聚，顏色從酒紅色變?yōu)樗{紫色。在雙鏈DNA中加入KM，由于適配體與KM結合，釋放出部分互補的單鏈DNA，單鏈DNA可以通過靜電作用吸附到AuNPs表面，保護AuNPs免于高鹽濃度引起的團聚，AuNPs的顏色未發(fā)生變化。

表1 樣品及回收率測定(n=3)

圖3 AuNPs比色法檢測KM選擇性圖Fig.3 Selectivity of colorimetric detection of KM based on AuNPsa.AuNPs+3 μmol/L KM；b.a+3 μmol/L GM； c.a+3 μmol/L NM； d.a+30 μmol/L SM； e.a+300 μmol/L TC

圖4 適配體金納米粒子比色法測定卡那霉素原理示意圖Fig.4 Schematic description of AuNPs based on colorimetric aptamer for kanamycin detection

2.2.2實驗條件優(yōu)化考察了反應時間對體系吸光度的影響。取10 μL 1 μmol/L 雙鏈DNA，加入10 μL 0.01 μmol/L KM，室溫孵育40 min后加100 μL AuNPs，再室溫孵育10 min后加0.5 mol/L NaCl，每2 min測一次紫外吸收光譜。結果表明，反應 10 min后吸光度比值基本恒定，因此，實選擇反應為12 min。

2.2.3分析特性在優(yōu)化的實驗條件下，圖5為加入不同濃度KM后AuNPs的紫外-可見吸收光譜圖和標準曲線圖。結果表明，吸光度比值((A0-A)/A)與KM在0.02～0.3 μmol/L濃度范圍內存在良好的線性關系，線性方程為:(A0-A)/A=0.8642c(μmol/L)+0.3505(r=0.9944)，檢出限(S/N=3)為8 nmol/L。

2.2.4實際樣品分析實際樣品牛奶的處理參照文獻方法[8]。將KM加入到處理好的牛奶樣品中，分別配制成含0.03、0.05、0.15 μmol/L KM的加標樣品，然后按照1.2方法測其吸光度，根據(jù)標準曲線計算回收率。測定結果如表2。

表2 樣品及回收率測定(n=3)

2.2.5選擇性分別考察了鏈霉素，新霉素，慶大霉素，四環(huán)素對適配體AuNPs對KM測定的影響。結果如圖6所示，結果顯示，加入同倍的新霉素(0.1 μmol/L)和慶大霉素，10倍鍵霉素、100倍的四環(huán)素，顏色無明顯變化，說明其他抗生素對測定沒有干擾。分析可能是由于KM與適配體具有高度特異性，故其他抗生素對卡那霉素適配體的測定基本沒有影響。

圖5 加入不同濃度KM后AuNPs-DNA-KM溶液的紫外-可見(UV-Vis)光譜和標準曲線Fig.5 UV-Vis spectra of AuNPs-DNA-KM after reaction with different concentrations of KM(Inset is the standard curve)cKM:a-d:0.02,0.04,0.1,0.3(μmol/L).

圖6 適配體金納米比色法檢測卡那霉素選擇性圖Fig.6 Selectivity of aptamer AuNPs coloorimetric detection of KMa.dsDNA+0.1 μmol/L KM+AuNPs+0.5 mol/L NaCl;b.a+0.1 μmol/L GM;c.a+0.1 μmol/L NM;d.a+10.0 μmol/L SM;e.a+100.0 μmol/L TC.

3 結論

利用AuNPs比色法構建了兩種簡單、靈敏、快速測定KM的新方法。方法一操作簡單，但選擇性較差。方法二由于采用了核酸適配體，檢測KM的線性范圍、檢出限和選擇性較方法一更好。這兩種方法可望用于其他抗生素和藥物的快速檢測。