李 耀， 劉木華， 袁海超， 趙進(jìn)輝

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院/生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045)

表面增強(qiáng)拉曼光譜法(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)[1-3]是一種具有高靈敏度、高分辨率、受水干擾小等特點(diǎn)的光譜檢測(cè)方法，其對(duì)吸附在金、銀或銅等膠質(zhì)金屬顆粒表面上的分子的拉曼光譜有很強(qiáng)的增強(qiáng)效果。SERS技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)、環(huán)境、食品安全等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，在抗生素殘留檢測(cè)方面也有相關(guān)的研究報(bào)道。XIE等[4]采用SERS技術(shù)快速測(cè)定和鑒定呋喃丹啶和呋喃它酮及其混合物，研究結(jié)果表明金納米粒子增強(qiáng)SERS法識(shí)別和表征呋喃丹啶和呋喃它酮是可行的。吉薇[5]采用金納米溶膠增強(qiáng)SERS來(lái)檢測(cè)肉類和牛奶中氯霉素及其琥珀酸鈉的殘留，獲得了較好的效果。Zhao等[6]采用SERS技術(shù)進(jìn)行了豬肉中萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅殘留量檢測(cè)與識(shí)別研究。

氧氟沙星(Ofloxacin，OFX)作為一種具有較好殺菌效果的第三代喹諾酮類廣譜抗生素，在鴨養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用。但對(duì)OFX的不合理使用很容易造成OFX在鴨體內(nèi)殘留超標(biāo)，進(jìn)而影響人體健康。雖然高效液相色譜、液-質(zhì)聯(lián)用等方法可用于鴨肉中OFX殘留檢測(cè)，但檢測(cè)過程復(fù)雜耗時(shí)。因此，研究一種鴨肉中的OFX殘留的快速檢測(cè)方法非常必要。有學(xué)者應(yīng)用SERS技術(shù)對(duì)左氧氟沙星水溶液進(jìn)行定性定量分析[ 7]，但還未見鴨肉中OFX殘留檢測(cè)的SERS研究報(bào)道。本研究以自制金納米顆粒作為增強(qiáng)試劑，建立了一種鴨肉中OFX殘留的SERS快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

OFX標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.0%，南昌精科科學(xué)儀器有限公司)溶液:用乙酸乙酯將10 mg OFX標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL棕色容量瓶中，超聲溶解后定容到刻度線，得到100 mg/L的OFX標(biāo)準(zhǔn)溶液。不同濃度的OFX標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙酸乙酯稀釋可得。HAuCl4·3H2O(Sigma-Aldrich)；檸檬酸三鈉、乙酸乙酯均為分析純(汕頭西隴化工股份有限公司)；無(wú)水Na2SO4、NaCl(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)室自制超純水作為本研究實(shí)驗(yàn)用水。

麻鴨購(gòu)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)。

1.2 儀器設(shè)備

海洋光學(xué)有限公司生產(chǎn)的QE65000便攜式拉曼光譜儀；北京普析通用儀器責(zé)任有限公司生產(chǎn)的T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)；湖南科爾頓水務(wù)有限公司生產(chǎn)的T10型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)；北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)的DL-1電子萬(wàn)用爐；江蘇省金壇市金南儀器廠生產(chǎn)的JJ-2B型組織搗碎勻漿機(jī)；合肥金尼克機(jī)械有限公司生產(chǎn)的JK-50B 型超聲波清洗器；上海上平儀器有限公司生產(chǎn)的FA1004B型電子天平；海門市其林貝爾儀器有限公司生產(chǎn)的VORTEX-5漩渦混合器；安徽嘉文儀器裝備有限公司生產(chǎn)的JW-1024低速離心機(jī)；北京成騰器材有限公司生產(chǎn)的石英進(jìn)樣瓶；石英比色皿(1 cm光程)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照文獻(xiàn)方法[8]制備金膠納米粒子：將2 mL HAuCl4(1%)置于500 mL燒杯中，加超純水定容到200 mL。用電子萬(wàn)用爐將其加熱至沸騰后，加1 mL檸檬酸三鈉(1%)，繼續(xù)加熱約8 min直至溶液顏色變紫紅色后，冷卻至室溫，4 ℃保存。

用組織搗碎機(jī)將鴨胸脯肉搗碎充分均勻后，密封后在-18 ℃下保存。將5 g搗碎的鴨胸脯肉和6.5 g無(wú)水Na2SO4置于50 mL離心管中，然后加入15 mL乙酸乙酯并渦旋1 min，超聲振蕩10 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液。重復(fù)提取一次，并合并兩次提取的上清液，然后用快速濾紙過濾得到所需的鴨肉提取液。稱取5 mg的OFX標(biāo)準(zhǔn)品溶于一定體積的鴨肉提取液中，超聲溶解后定容到刻度線，得到含100 mg/L OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本。再將其依次稀釋可得含不同濃度OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本。

向2 mL的石英進(jìn)樣瓶中依次加入500 μL金膠、10 μL含不同濃度OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本和120 μL NaCl溶液(0.1 mol/L)，混合均勻后放入樣本池中進(jìn)行SERS光譜采集。儀器參數(shù)設(shè)置如下：光譜儀激光功率400 mW，激光波長(zhǎng)785 nm，積分時(shí)間10 s，積分平均2次，并選擇400～ 1 800 cm-1波段范圍的拉曼光譜進(jìn)行研究。

對(duì)金膠加入量、待測(cè)液樣本加入量、NaCl溶液加入量及吸附時(shí)間分別進(jìn)行單因素分析，以確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件。在最佳的條件下，采集樣本的SERS光譜，且熒光等背景信號(hào)采用自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法算法(air-PLS)扣除。其中，所有樣本的光譜均采集3次，并在數(shù)據(jù)分析中采用3次測(cè)量的平均值作為樣本的SERS光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見吸收光譜

圖1 紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectrum(a) Gold colloid;(b) Gold colloid+duck meat extract containing OFX (5 mg/L)+NaCl.

本研究選用1 mL超純水稀釋500 μL金膠作為樣本1；將500 μL金膠、10 μL含OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本(5 mg/L)與120 μL NaCl溶液混合，再加入1 mL超純水稀釋作為樣本2，采集這兩個(gè)樣本的紫外-可見吸收光譜，其紫外-可見吸收光譜曲線分別見圖1中曲線a、b所示。由曲線a可觀察到，金膠的最大吸收峰約在538 nm處，半峰寬約66 nm。由曲線b可以看出，金膠、含OFX的鴨肉提取液和NaCl溶液的混合液最大吸收峰為544 nm，相比金膠的吸收峰發(fā)生了6 nm的紅移，峰形也顯得更寬。該現(xiàn)象表明，由于OFX分子與金膠納米粒子表面發(fā)生吸附或結(jié)合，使得金膠納米粒子表面的等離子共振性質(zhì)發(fā)生了改變，進(jìn)而影響了金納米粒子的大小或聚集狀態(tài)[9]。

2.2 鴨肉中OFX的SERS分析

圖2 (a) 鴨肉提取液的SERS；(b) 乙酸乙酯的SERS；(c) 鴨肉提取液加標(biāo)樣本的普通拉曼光譜(5 mg/L)；(d) OFX標(biāo)準(zhǔn)品的SERS(5 mg/L)；(e) 含OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的SERS(5 mg/L)Fig.2 (a) SERS of duck meat extract；(b) SERS of ethyl acetate；(c) Normal Raman spectrum of duck meat extract containing OFX (5 mg/L)；(d) SERS of OFX solution(5mg/L)；(e) SERS of duck meat extract containing OFX (5 mg/L)

分別采集鴨肉提取液樣本、乙酸乙酯的SERS及含OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的普通拉曼光譜，OFX標(biāo)準(zhǔn)品的SERS和含OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的SERS，其光譜曲線如圖2所示。對(duì)比圖中曲線b與曲線d可知，在曲線d中1 123、1 307、1 399、1 492和1 597 cm-1處出現(xiàn)明顯很高的峰值且較為穩(wěn)定，而在曲線b上這幾處位置均無(wú)拉曼峰，并且在曲線d上1 307 cm-1處所得峰值是上述幾處拉曼峰中最高的，由此考慮將此處特征峰作為檢測(cè)OFX的拉曼特征峰。同時(shí)，對(duì)比曲線d、e與曲線a，在含OFX的鴨肉提取液的SERS曲線e中，觀察到在上述幾個(gè)明顯較高峰值處也能得到與曲線d類似的峰譜，而且在1 307 cm-1處所得峰值也為最高。但在鴨肉提取液的SERS曲線a中無(wú)法得到相關(guān)譜峰。從上述分析確定以1 307 cm-1處的峰值可作為本研究中OFX檢測(cè)的最佳特征峰，后期實(shí)驗(yàn)均以此處峰值作為OFX的定性定量考察依據(jù)。將曲線c和曲線e對(duì)比可知，含OFX鴨肉提取液的拉曼光譜所得到的譜峰單一，且強(qiáng)度不高，不利于對(duì)OFX的考察；不過在加入金膠和NaCl溶液后所測(cè)得的含OFX鴨肉提取液的SERS光譜，具有峰值明顯且較多的特點(diǎn)，這也證明了金膠和NaCl溶液對(duì)加標(biāo)樣本的拉曼峰有較好的增強(qiáng)效果。

2.3 金膠加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響

分別將不同體積的膠體(200、300、500、700、900 μL)加入10 μL含5 mg/L OFX的鴨肉提取液樣本和120 μL NaCl溶液混合，然后采集它們的SERS光譜數(shù)據(jù)。分析所得到的SERS光譜曲線，當(dāng)膠體加入量為500 μL時(shí)，1 307 cm-1特征峰處的強(qiáng)度達(dá)到最高，而且相比其他加入量所測(cè)得的SERS光譜曲線更為清晰，峰值更加明顯。研究結(jié)果顯示，特征峰的強(qiáng)度隨著膠體加入量增加，它呈現(xiàn)為先增再減的趨勢(shì)，當(dāng)金膠加入量在500 μL時(shí)所得峰強(qiáng)可達(dá)到最高。由此確定，金膠的最佳加入量為500 μL。

2.4 待測(cè)液樣本加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響

由于待測(cè)液中的OFX分子與金膠納米粒子發(fā)生了表面等離子體共振而產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼效果。在確定金膠的加入量后，鴨肉提取液加標(biāo)樣本中OFX分子量的變化會(huì)對(duì)拉曼光譜增強(qiáng)影響很大。實(shí)驗(yàn)中固定500 μL金膠量，分別加入不同量(5、10、15、20、30 μL)的含5 mg/L OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本，再加入120 μL的NaCl溶液，分別采集SERS光譜。分析所得到的SERS光譜曲線，在OFX1 307 cm-1特征峰位置處所測(cè)得的峰值在各曲線中均為最高，特別是待測(cè)液量為10 μL時(shí)的1 307 cm-1處特征峰強(qiáng)度為各曲線光譜強(qiáng)度的峰值。結(jié)果表明，待測(cè)液加入量的不同對(duì)特征峰峰強(qiáng)的影響很大，特征峰1 307 cm-1處峰強(qiáng)在待測(cè)液量為5～10 μL時(shí)呈上升趨勢(shì)，在待測(cè)液超過10 μL時(shí)所得特征峰峰強(qiáng)相對(duì)較低，故本研究實(shí)驗(yàn)中最佳待測(cè)液量定為10 μL。

2.5 NaCl溶液加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響

本研究以自制金膠作為表面增強(qiáng)基底，當(dāng)待測(cè)液的分子吸附增強(qiáng)基底后，使膠體出現(xiàn)凝聚，膠體的凝聚程度對(duì)SERS效應(yīng)影響很大[10]。在拉曼光譜檢測(cè)中，加入一定濃度的電解質(zhì)可以對(duì)溶膠起誘導(dǎo)和活化作用，改變了待測(cè)分子與增強(qiáng)基底的聚集程度，影響了電磁場(chǎng)的增強(qiáng)機(jī)理，對(duì)SERS信號(hào)起到增強(qiáng)的效果[11]。本實(shí)驗(yàn)以NaCl溶液作為膠體的活化劑，來(lái)改變納米粒子的團(tuán)聚效果。金膠加入量500 μL，加入10 μL含5 mg/L OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本，再分別加入不同量的NaCl溶液(50、70、100、120、150 μL)，分別采集SERS光譜。結(jié)果表明，在NaCl溶液加入量小于120 μL時(shí)，所得特征峰峰強(qiáng)是呈逐漸上升的趨勢(shì)，這可能是由于金納米顆粒帶負(fù)電，一定量的NaCl溶液中的Na+中和金膠納米粒子帶的負(fù)電荷，從而增強(qiáng)了OFX分子與金膠納米粒子的凝聚程度，使得拉曼信號(hào)得以提升。在NaCl溶液加入量為150 μL時(shí)，過量的NaCl分子可能引起了納米粒子的團(tuán)聚，反而降低了SERS信號(hào)的強(qiáng)度。確定NaCl溶液的最佳加入量為120 μL。

2.6 SERS信號(hào)受吸附時(shí)間的影響

圖3 吸附時(shí)間對(duì)SERS信號(hào)的影響Fig.3 Effect of adsorption time on SERS intensity(a)1 min;(b)5 min;(c)10 min;(d)15 min;(e) 20 min.

研究發(fā)現(xiàn)，樣本與金膠基底吸附反應(yīng)時(shí)間會(huì)對(duì)所采集到SERS強(qiáng)度存在一定影響。本實(shí)驗(yàn)固定膠體量為500 μL，加入10 μL含5 mg/L OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本，再加入120 μL NaCl溶液，分別經(jīng)過1、5、10、15、20 min后，采集SERS光譜。由圖3可知，在特征峰1 307 cm-1處得到的拉曼光譜強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加逐漸降低。經(jīng)研究分析，金膠納米粒子與OFX分子吸附反應(yīng)后發(fā)生一定的聚集，產(chǎn)生活性熱點(diǎn)來(lái)決定SERS的增強(qiáng)效果[5]。吸附反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)活性熱點(diǎn)影響很大，時(shí)間過短時(shí)膠體粒子與待測(cè)液的分子無(wú)法充分吸附，使得光譜信號(hào)很弱；吸附時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)有可能會(huì)使得膠體產(chǎn)生聚沉，也會(huì)降低SERS光譜的強(qiáng)度[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，選擇OFX分子與金膠納米粒子吸附時(shí)間1 min時(shí)測(cè)試，特征峰處所得的光譜強(qiáng)度可達(dá)到最高。故樣本混合1 min時(shí)測(cè)試得到的SERS增強(qiáng)效果較佳。

2.7 鴨肉中OFX的SERS定量分析

采集不同濃度OFX(0.05、0.1、0.2、0.5、0.7、2.0、4.0、7.0、8.0、10.0和11.0 mg/L)的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的SERS光譜，如圖4所示。以鴨肉中OFX的濃度(x)為橫坐標(biāo)，拉曼特征峰的峰強(qiáng)(y)為縱坐標(biāo)，繪制出OFX濃度與各濃度在特征峰1 307 cm-1位置峰強(qiáng)的關(guān)系。結(jié)果表明，特征峰處所得SERS強(qiáng)度與鴨肉中所含OFX濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為:y=1357.9x+33.737，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9946，檢測(cè)限為0.05 mg/L。施祖灝等采用高效液相色譜法檢測(cè)OFX的檢測(cè)限為0.01 mg/L[13 ]，低于本研究采用SERS檢測(cè)鴨肉中OFX的檢測(cè)限，在后期的研究中，可以通過優(yōu)化前處理方法或選擇增強(qiáng)效果更好的納米粒子來(lái)獲取更低的OFX檢測(cè)限。

選用不同濃度OFX的鴨肉提取液加標(biāo)樣本做回收實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的可靠性。本研究以O(shè)FX含量為1.0、5.0、7.0和9.0 mg/L的鴨肉提取液加標(biāo)樣本作預(yù)測(cè)，表1為這4個(gè)濃度的預(yù)測(cè)值和回收率。由表1可知，樣本回收率為89%～106%，這表明用該方法檢測(cè)鴨肉中的OFX殘留是可靠的。

表1 鴨肉加標(biāo)樣本回收率(n=3)

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了鴨肉中的OFX殘留，樣本經(jīng)過前處理后，利用QE65000便攜式拉曼光譜儀采集樣本的SERS光譜，并最終確定了鴨肉中的OFX殘留檢測(cè)的定量分析模型。本方法操作簡(jiǎn)單，樣本的前處理時(shí)間較短，能夠滿足鴨肉中OFX殘留檢測(cè)的要求，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。