霍彩霞， 何麗君， 楊天宇

(1.蘭州城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

氯酚類污染物2,4,6-三氯苯酚(TCP)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，溶解度大，降解性能極差，土壤等固體物質(zhì)對其的吸附和固定作用很弱[1]，在環(huán)境和生物體內(nèi)有富集作用,容易引起生物體致癌和致突變等，被列為EPA129種優(yōu)先污染物和我國68種優(yōu)先監(jiān)測污染物之一[2]。進入機體的TCP與蛋白質(zhì)相互作用是決定其在體內(nèi)運輸、分配、致毒和代謝活性的主要因素，因此研究其與血清白蛋白相互作用，對于深入探索其致毒、代謝和解毒機制具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。然而目前對環(huán)境中TCP的檢測和降解關(guān)注較多[3 - 6]，而對其與人體中蛋白質(zhì)的相互作用研究較少[7]。

本文在模擬人體生理條件下，運用熒光光譜、紫外吸收光譜、循環(huán)伏安法和分子對接技術(shù)，研究了TCP與人血清白蛋白(HSA)的相互作用，以及檸檬酸、維生素C等小分子介入對TCP與HSA相互作用的影響，為深入研究其在人體內(nèi)致毒、代謝和解毒機制提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度計，UV-2550紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；CH604電化學(xué)分析儀(上海晨華儀器有限公司)，電化學(xué)實驗采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極(GEC)為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極(SEC)為參比電極。

人血清白蛋白(HSA)(生化試劑，美國Sigma公司)溶液：用Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.40)配成濃度為1.0×10-4mol·L-1的儲備液，保存于4 ℃冰箱；2,4,6-三氯苯酚(TCP)(98%，阿拉丁(上海)化學(xué)試劑有限公司)溶液：用乙醇配制成濃度為2.676×10-4mol·L-1儲備液；B-R緩沖溶液：pH=7.40；Tris-HCl緩沖溶液：含0.1 mol·L-1NaCl溶液維持離子強度，pH=7.40；無水乙醇、檸檬酸、維生素C等試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1熒光光譜測定于1 cm石英比色皿中，加入3.0 mL 1.0×10-6mol·L-1的HSA溶液，然后用滴定的方法依次加入10 μL的TCP(2.676×10-5mol·L-1)，攪勻，放置7 min，設(shè)定λex=282 nm，在溫度為300、305、310 和315 K下掃描熒光光譜和同步熒光光譜(310 K，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm)。

取3.00 mL 1.0×10-6mol·L-1HSA溶液兩份，分別加入10 μL 4.4×10-4mol·L-1的檸檬酸和維生素C溶液，依次滴入10 μL TCP(2.676×10-5mol·L-1)溶液，同樣設(shè)置參數(shù)，測定310 K時體系的熒光光譜。

1.2.2紫外吸收光譜測定以pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液為參比，測定200～400 nm波長范圍內(nèi)等濃度HSA、TCP及TCP和HSA摩爾比為1∶1 溶液的紫外吸收光譜。

1.2.3電化學(xué)測試方法玻碳電極用電極拋光材料拋光至鏡面，依次用無水乙醇和蒸餾水超聲清洗。采用循環(huán)伏安法研究TCP、HSA及TCP-HSA在pH=4.70的B-R緩沖溶液中的電化學(xué)行為。

1.2.4計算機模擬分子對接實驗TCP的構(gòu)建在Chemoffice2008>ChemBioDraw Ultra11.0中完成，在Chemoffice2008>ChemBio3D Ultra11.0中加MM2力場完成初步優(yōu)化，并保持化合物的手性構(gòu)型。初步優(yōu)化的TCP配體在Schrodinger>LigPrep中進行加電荷、質(zhì)子化狀態(tài)處理，HSA與warfarin復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)取自PDB數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank，PDB code：1H9Z)。對HSA的處理(加氫、添加偏電荷、調(diào)整質(zhì)子化狀態(tài))所用的力場為OPLS-2005力場。在Schrodinger>Glide>Ligand Docking中將TCP對接到人血清白蛋白活性口袋中(PDB code：1H9Z)，對接參數(shù)均采用軟件缺省值。

2 結(jié)果與討論

2.1 TCP與HSA相互作用機制

2.1.1TCP與HSA相互作用的光譜研究圖1為TCP-HSA體系的熒光光譜圖。隨著TCP濃度不斷增大，337 nm處HSA的熒光強度有規(guī)律地降低，且最大發(fā)射峰峰形未變，峰位有輕微藍(lán)移，表明TCP與HSA發(fā)生了相互作用。TCP對HSA熒光猝滅的方式有靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，動態(tài)猝滅常數(shù)可由Stern-Volmer方程求得[8]。在實驗溫度下的動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq見表1，在300～315 K范圍內(nèi)，TCP與HSA的Kq均在1013數(shù)量級，遠(yuǎn)大于猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1[9]，初步表明TCP與HSA的熒光猝滅作用為靜態(tài)猝滅。

在模擬人體生理條件下，測得了TCP、HSA及TCP與HSA等摩爾比的紫外吸收光譜圖(圖2)。加入TCP后，HSA在280 nm處的吸收峰的強度降低且峰位發(fā)生藍(lán)移，表明TCP與HSA作用形成基態(tài)復(fù)合物，從而導(dǎo)致HSA吸收光譜的改變，進一步證實了TCP與HSA相互作用機理為靜態(tài)猝滅[10]。

圖1 TCP-HSA體系的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of HSA in the presence of TCPλex=282 nm,T=310 K;cHSA=1.0×10-6 mol·L-1,cTCP：0，0.8890，1.772，2.636，3.521，4.386，5.247，6.102(×10-7 mol·L-1).

圖2 TCP、HSA及TCP-HSA等摩爾混合體系的紫外(UV)吸收光譜圖Fig.2 UV spectra of TCP,HSA and TCP-HSApH=7.40,T=310 K;cHSA=cTCP=1.0×10-5 mol·L-1.

圖3 TCP與HSA在玻碳電極上的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammetry of TCP and HSA on a glass carbon electrodeT=298 K,pH=4.70,scan rate:60 mV·s-1,cTCP=2.683×10-4 mol·L-1,cHSA=1.0×10-6 mol·L-1.

2.1.2TCP與HSA相互作用的電化學(xué)研究在-0.8～1.0 V電位范圍內(nèi)，采用循環(huán)伏安法研究了TCP、HSA及TCP-HSA在pH=4.70的B-R緩沖溶液中的電化學(xué)行為(圖3)。結(jié)果TCP出現(xiàn)了一對氧化還原峰(曲線a)，峰電位分別為:Epa=0.687 V、Epc=0.125 V，HSA未出現(xiàn)氧化還原峰(曲線b)，而TCP中加入HSA后，體系的峰電位發(fā)生明顯改變，峰電流隨之降低(曲線c)，表明TCP和HSA發(fā)生相互作用，形成了不具有電化學(xué)活性的復(fù)合物。

2.2 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及作用力

TCP和HSA的猝滅機理為靜態(tài)猝滅，其符合公式lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgc，以lg[(F0-F)/F]對lgc作圖，依截距和斜率求得二者的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點數(shù)n，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：TCP與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)較大，約有1個結(jié)合位點。在模擬人體正常體溫310 K時，王洋等[11]得到的2,4-二氯苯酚-HSA的KA為9.760×104L·mol-1，但比TCP-HSA的KA小，說明三氯酚與HSA的相互作用更強。根據(jù)表1中熱力學(xué)參數(shù)和Ross等[12]的觀點可推斷出，ΔG<0，說明TCP與HSA之間結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進行，ΔH<0、ΔS>0，表明兩者間存在靜電作用和疏水作用。

表1 TCP與HSA相互作用參數(shù)表

2.3 檸檬酸和維生素C對反應(yīng)體系的影響

從表2可看出，在模擬人體生理條件下(pH=7.40,T=310 K)，檸檬酸和維生素C的介入對TCP與HSA熒光的猝滅方式無影響，但二者的KA和n顯著降低，TCP與HSA的結(jié)合能力大大減弱，說明可以通過食物適量攝入檸檬酸和維生素C等營養(yǎng)成分來降低TCP對人體的傷害。

表2 檸檬酸和維生素C存在下TCP與HSA相互作用參數(shù)

2.4 TCP的協(xié)同性考察

根據(jù)文獻方法[13 - 14]，通過Hill方程分析了具有多重結(jié)合部位的HSA與配體TCP結(jié)合過程中各結(jié)合部位之間存在相互影響作用的可能性。Hill系數(shù)nH表示二元體系中同類配體之間結(jié)合的影響，其余參數(shù)意義及求算方法見文獻報道[13 - 14]。由表1可知，在研究溫度下nH值略大于1，說明TCP與HSA結(jié)合過程中，TCP分子間呈現(xiàn)微弱的正協(xié)同作用，前一個TCP分子結(jié)合到HSA位點上后，對后一個TCP分子與HSA相互結(jié)合的促進作用較弱。

2.5 TCP與HSA作用的分子對接研究

研究發(fā)現(xiàn)華法林和布洛芬在血清白蛋白上的結(jié)合部位分別為亞螺旋域ⅡA和ⅢA[15]。以華法林和布洛芬為標(biāo)記藥物，通過競爭實驗分析TCP與HSA相互作用的結(jié)合部位。在310 K測定一定濃度的競爭試劑(華法林和布洛芬)存在時TCP-HSA體系的熒光強度。結(jié)果表明，KA由原來1.520×105L·mol-1分別變?yōu)?.358×104和7.652×104L·mol-1，且華法林存在時變化更顯著，說明TCP在亞螺旋域ⅡA與HSA發(fā)生作用。

圖4是TCP與HSA的計算機模擬分子對接圖。由于TCP體積較小，只占據(jù)氨基酸殘基組成的一個ⅡA疏水空腔(圖4A)，它周圍20 ?范圍內(nèi)的疏水殘基(L238、L219、A291、I290、A261、I264、L260及V241)與TCP中的苯環(huán)間存在較強的疏水力，而TCP的pKa為6.15,在pH=7.40時，苯環(huán)上的羥基發(fā)生部分解離，帶有負(fù)電荷，與HSA中帶正電的氨基酸基團間有靜電作用(圖4B)，二者共同作用使TCP與HSA結(jié)合形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

圖4 TCP在HSA的結(jié)合口袋和分子對接圖Fig.4 TCP combines pockets and molecular docking in HSA

2.6 TCP對HSA構(gòu)象的影響

固定HSA的濃度，逐漸增加TCP的濃度，分別在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的條件下測定HSA的同步熒光光譜。由圖5可見，隨著TCP濃度增加，酪氨酸殘基的發(fā)射峰峰位和峰高均未變(圖5A)，而色氨酸殘基的熒光強度有規(guī)律地猝滅且峰位略有藍(lán)移(圖5B)，表明TCP的加入使HSA的色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，導(dǎo)致HSA的熒光團所處環(huán)境的疏水性增加，極性減小，蛋白質(zhì)趨于收縮，TCP對HSA的構(gòu)象有一定的影響。

圖5 TCP對HSA構(gòu)象的影響Fig.5 Effect of TCP on the configuration of HSAλ ex=282 nm,T=310 K;cHSA=1.0×10-6 mol·L-1,cTCP(1-7):0，0.8890，1.772，2.636，3.521，4.386，5.247(×10-7 mol·L-1).

3 結(jié)論

本文運用熒光光譜、紫外光譜、循環(huán)伏安法和分子對接技術(shù)，研究了TCP與HSA間的相互作用。實驗表明在人體生理條件下，TCP使HSA的熒光以靜態(tài)猝滅形式發(fā)生作用，求得了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，推斷出相互作用力，進一步通過分子對接技術(shù)進行佐證，與實驗結(jié)果推斷一致；檸檬酸和維生素C的介入則對TCP與HSA的作用有顯著影響，適當(dāng)提高血液中檸檬酸和維生素C的濃度，有助于降低TCP對人體的傷害；nH值略大于1，說明TCP分子間呈現(xiàn)微弱的正協(xié)同作用；同步熒光則表明TCP對HSA的構(gòu)象有一定影響。