袁躍華， 朱永軍， 殷強鋒， 馮 鋒， 王海雁， 田茂忠*

(1.山西大同大學化學與環(huán)境工程學院，山西大同 0370092.華東理工大學化工學院，上海 200237)

銅是自然界和生物體中特別重要的過渡金屬元素之一，Cu2+的缺少或過量存在對生物體有不利影響[1 - 2]，會引起動植物病變甚至死亡，因此，監(jiān)控生物體內(nèi)和環(huán)境載體中Cu2+的濃度十分必要。

相對于其他方法，熒光檢測分析方法具有選擇性好、靈敏度高[3]等優(yōu)點，故基于熒光檢測方法的Cu2+探針的研究近年來引起了眾多科學工作者的關(guān)注[4 - 8]。由于Cu2+具有順磁性特點，Cu2+的檢測往往會引起探針的熒光信號猝滅[9]，從而不利于提高檢測的靈敏度。但是，具有內(nèi)酰肼螺環(huán)結(jié)構(gòu)的羅丹明類染料識別Cu2+前處于不發(fā)光的非共軛狀態(tài)，當探針分子與Cu2+發(fā)生作用時，可引發(fā)螺環(huán)開環(huán)，開啟共軛體系，恢復羅丹明熒光團的發(fā)光性能，從而達到通過熒光增強檢測Cu2+的目的[10 - 14]。

到目前為止，已有大量的文獻報道基于羅丹明內(nèi)酰胺的金屬離子探針[15 - 17]。從其結(jié)構(gòu)和性能來看，在識別金屬離子后羅丹明6G類熒光探針的最大發(fā)射波長比羅丹明B類熒光探針的小。一般來說，羅丹明酰胺類熒光探針的識別機理是金屬離子絡合誘導螺環(huán)開環(huán)后使得探針熒光增強，識別金屬離子的過程可逆；但是，羅丹明酰肼類熒光探針有時識別金屬離子過程不可逆，探針熒光增強是由于金屬離子誘導其螺環(huán)開環(huán)，然后發(fā)生水解反應所致。本文基于Cu2+可促進羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺水解的機制[18]，以雙羅丹明6G為熒光基團，設計合成了Cu2+選擇性反應型螺環(huán)酰肼熒光探針分子RG1。 實驗結(jié)果表明，引入兩個水合肼基官能團不但增強了探針的水溶性，并保持了其肼類衍生物的識別性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2500熒光分光光度計(日本，日立公司)；pHS-25B 型pH酸度計(上海大中分析儀器廠)；DRX-400核磁共振儀(瑞士，Bruker公司)；Saturn 2200/2100 質(zhì)譜儀(美國，Varian 公司)；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；R215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士，BUCHI公司)。

RG1標準溶液：準確稱取一定量探針RG1，溶于二甲亞砜(DMSO)，制成濃度為1.0×10-2mol/L的貯備液，使用時根據(jù)需要適當稀釋。金屬離子溶液：準確稱取一定量各金屬離子硝酸鹽，溶于二次蒸餾水中，制成濃度為2.0×10-2mol/L的貯備液，使用時根據(jù)需要適當稀釋。羅丹明6G購自百靈威試劑有限公司；水合肼(85%)、乙二醛(40%)和其它試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。柱層析硅膠為200～300目(青島Makall公司)。水為二次蒸餾水。

1.2 探針的制備

探針的合成路線如下所示：

1.2.1化合物RG3的合成參照文獻方法[15]，將羅丹明6G 2.0 g(4.5 mmol)加入裝有50 mL乙醇的100 mL燒瓶中。室溫下，劇烈攪拌，慢慢滴入85%的水合肼6.0 mL(過量)。滴加完畢后，攪拌回流2 h。冷卻溶液，減壓蒸去乙醇。然后加入大約100 mL HCl(1 mol/L)，得到紅色溶液；不斷攪拌下，再慢慢加入大約140 mL NaOH溶液(1 mol/L)，直到pH達到9～10之間，出現(xiàn)大量白色沉淀。過濾，并用30 mL水洗滌濾餅3次。真空干燥后，初產(chǎn)品用柱色譜分離得到1.18 g化合物RG3(60.9%)。

1.2.2化合物RG2的合成將RG3 500.0 mg(1.2 mmol)加入50 mL的單口燒瓶中，再加入15 mL無水甲醇和40%乙二醛水溶液1.0 mL，然后在氮氣保護下，室溫攪拌8 h，減壓蒸去溶劑。把粗產(chǎn)品溶在2 mL 的二氯甲烷中，用硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=6∶1(V∶V),得到317.3 mg的黃色固體RG2(30.9%)。1H NMR(400 MHz,CD3CN) δH9.23(s,1H),9.21(s,1H),7.97(d,J=7.6 Hz,1H),7.65～7.52(m,4H),7.43(d,J=7.6 Hz,2H),7.03(d,J=7.6 Hz,1H),6.34(s,4H),6.28(s,4H),4.17(s,2H),3.18(q,J=7.2 Hz,8H),2.13(s,2H),1.85(s,12H),1.24(t,J=7.2 Hz,12H)。13C NMR(100 MHz,CD3CN) δC192.15,187.78,165.26,153.01,151.48,148.63,140.57,135.49,128.99,127.59,124.33,119.63,103.98,96.34,65.85,37.97,16.10,13.61。HRMS:m/z計算值:C54H55N8O4[M+H]+:879.4346，實測值:879.4341。

1.2.3化合物RG1的合成將RG2 200.0 mg(0.2 mmol)加入50 mL的單口梨形燒瓶中，再加入10 mL無水乙醇，然后在氮氣保護及室溫攪拌下，慢慢分多次加入NaBH415.2 mg(0.4 mmol),加完后室溫下再攪拌2 h。減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)品溶于10 mL二氯甲烷中，加入3 mL K2CO3溶液(0.1 mol/L)，有機相用無水MgSO4干燥，過濾，蒸去溶劑，把固體溶在2 mL的二氯甲烷中。用硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1(V∶V),得到184.1 mg的白色固體RG1(91.6%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ 7.92(dd,J=5.9,2.7 Hz,2H),7.57～7.39(m,4H),7.08(dd,J=5.9,2.7 Hz,2H),6.36(s,4H),6.18(s,4H),4.55(t,J=7.0 Hz,2H),4.39(t,J=7.0 Hz,2H),3.51(s,4H),3.32～3.33(d,2H),3.19(m,8H),1.88(s,12H)。1.30(t,J=7.1 Hz,12H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3) δ 178.88,167.99,152.12,151.45,147.45,133.00,129.67,128.29,127.92,123.94,122.87,117.69,105.43,96.61,66.24,58.43,52.43,38.25,16.62,14.64。HRMS:m/z計算值:C54H59N8O4[M+H]+:883.4659，實測值:883.4667。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜分析

圖1 探針RG1(10 μmol/L)對金屬離子(濃度均為50 μmol/L)響應的紫外-可見(UV-Vis)光譜Fig.1 UV-Vis response of probe RG1(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L)

通過紫外-可見光譜研究了探針分子RG1對Cu2+的識別作用。由圖1可見，在體積比為1∶1的乙腈-水溶液(10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.2)體系中，探針分子RG1(10 μmol/L)在可見光譜區(qū)(400～700 nm)幾乎沒有吸收，當加入Cu2+后，紫外-可見光譜在525 nm處出現(xiàn)很強的吸收峰，同時溶液顏色從無色變?yōu)榉奂t色。這種現(xiàn)象表明探針分子RG1對Cu2+有良好的識別功能。Cu2+誘導探針分子的羅丹明內(nèi)酰肼螺環(huán)打開，使得摩爾吸光系數(shù)大幅度增大，可達到4.81×104L/(mol·cm)。另外，還研究了其它常見的金屬離子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe3+、Ni2+、Cr3+、Cd2+、Mn2+、Pb2+、Ag+、Zn2+、Hg2+與探針分子RG1之間的相互識別作用。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，除了Fe3+可引起熒光分子探針RG1的吸收強度稍微增加外，其它金屬離子均未引起探針分子RG1可見區(qū)吸光度較明顯的增大，溶液顏色也未發(fā)生明顯變化。所以，探針RG1可以用作Cu2+的顯色傳感。

2.2 熒光光譜分析

在相同的乙腈-水溶液體系中，利用熒光光譜評價了探針分子RG1對上述常見金屬陽離子的識別功能。由圖2(A)可見，當用510 nm的光激發(fā)時，探針分子RG1(10 μmol/L)的熒光強度很弱。當向探針溶液中加入一定濃度的Cu2+后，發(fā)現(xiàn)探針分子RG1的熒光增強非常明顯。除了Fe3+對探針的熒光光譜稍有影響外，加入其它金屬離子后探針的熒光光譜相對變化都很小，說明此探針對這些金屬離子沒有識別響應。同時，實驗考察了探針分子RG1識別Cu2+時受其它金屬陽離子干擾的情況。從圖2(B)可以看出，在不同金屬離子選擇性實驗的體系中，再加入一定濃度的Cu2+都能引起熒光強度的大幅度增加，說明這些離子不干擾探針分子對Cu2+的特異性識別。結(jié)果表明，探針分子RG1對Cu2+有良好的選擇性。

圖2 (A) 探針RG1對金屬離子的選擇性(探針RG1的濃度為10 μmol/L,金屬離子的濃度均為50 μmol/L);(B)其他金屬離子和Cu2+(50 μmol/L)共存時探針RG1熒光強度的變化Fig.1 (A) Fluorescence response of probe RG1(10 μmol/L) to different metal ions(50 μmol/L);(B) Fluorescence intensity changes of RG1 upon the addition of various metal ions in and without the presence of Cu2+

2.3 Cu2+濃度對探針分子熒光光譜的影響

為了進一步考察探針分子RG1熒光強度變化與Cu2+濃度之間的關(guān)系，在相同的乙腈-水溶液體系中進行了Cu2+熒光滴定實驗，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，隨著Cu2+濃度的逐漸增大，探針分子RG1在553 nm處的熒光強度不斷增強，當Cu2+濃度增大到6倍時，探針的熒光強度接近飽和。Cu2+濃度在3.0×10-6～1.5×10-5mol/L范圍內(nèi)與探針熒光發(fā)射強度(553 nm)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=8.84x+7.43，相關(guān)系數(shù)R2=0.9910。Cu2+檢出限(S/N=3)為3.31×10-7mol·L-1。上述結(jié)果表明，探針RG1可以定量檢測此范圍內(nèi)Cu2+的含量，靈敏度較高。

2.4 pH對探針分子熒光光譜的影響

考察了不同pH體系探針分子的熒光光譜。由圖4可見，在未加入Cu2+時，在pH=4～10范圍內(nèi)幾乎探測不出明顯的熒光信號，說明在此范圍內(nèi)對體系pH變化不敏感。另外，評估了加入Cu2+后，pH對探針RG1熒光光譜的影響，發(fā)現(xiàn)在pH=5～10范圍內(nèi)，探針的熒光強度明顯增大，以上結(jié)果表明，此探針可在較寬的pH范圍內(nèi)直接檢測Cu2+的濃度。

圖3 逐漸加入Cu2+(0～80 μmol/L)為探針RG1(10 μmol/L)的熒光發(fā)射光譜圖Fig.3 Fluorescence emission spectra of probe RG1 in the presence of Cu2+ with concentration increased[Cu2+]：a-n:0-80 μmol/L；[RG1]=10 μmol/L.

圖4 pH對探針RG1熒光強度(λem=553 nm)的影響Fig.4 Eeffect of pH on the fluorescence intensity(λem=553 nm) of probe RG1(a) free probe RG1(10 μmol/L);(b) probe RG1+Cu2+.[Cu2+]=50 μmol/L;Excitation at 510 nm.

2.5 探針識別機理探討

為了了解探針RG1對Cu2+的識別機理，考察了EDTA對探針RG1和Cu2+作用體系熒光光譜的影響。發(fā)現(xiàn)當向探針識別Cu2+的體系中加入過量的EDTA時，熒光光譜的變化很小，表明Cu2+的識別過程不可逆。此外，通過HRMS對探針識別Cu2+的溶液進行測試，發(fā)現(xiàn)生成了探針RG1的水解產(chǎn)物，[M+H]+計算值：415.2022,實測值：415.2015。由此可以進一步證明探針RG1對Cu2+的識別機理[18]為探針分子中識別部位氮原子和氧原子先與Cu2+鍵合引起探針分子螺內(nèi)酰肼開環(huán)，然后進一步水解生成化合物R1，從而誘導熒光明顯增強，如圖5所示。

圖5 探針RG1識別Cu2+的機理Fig.5 Proposed mechanism of probe RG1 detecting Cu2+

2.6 樣品檢測及加標回收試驗

取河水水樣，按實驗方法測定其熒光強度，并進行加標回收試驗，結(jié)果如表1，平均回收率為100.7%，相對標準偏差(RSD)為2.3%。因此，該方法具有較好的準確度和精密度。

表1 水樣中Cu2+的檢測(n=5)

3 結(jié)論

合成了一種新的熒光增強型Cu2+熒光探針。在熒光探針RG1的水溶液中，加入Cu2+后會引發(fā)探針螺環(huán)開環(huán)，然后發(fā)生水解，導致熒光明顯增強。方法檢測Cu2+的靈敏度高、選擇性好，檢出限為3.31×10-7mol/L，而且，探針可以在比較寬的pH范圍內(nèi)對Cu2+實施檢測。