黃 穎， 陳 美， 張翠云

(福建師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，福建福州 350007)

酪胺(TA)在生物機(jī)體的正常代謝中具有重要的生理功能。微量的TA能夠刺激調(diào)節(jié)大腦皮層及其精神活動(dòng)，對(duì)血管的收縮和舒張具有明顯調(diào)節(jié)作用。少量的TA不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生影響，但攝入過(guò)量時(shí)會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒副作用，嚴(yán)重的還會(huì)危及生命[1]，因此對(duì)食品中TA的分析檢測(cè)至關(guān)重要。谷胱甘肽(GSH)是生物體內(nèi)主要的含巰基三肽化合物，具有解毒、防輻射、抗衰老等作用[2 - 3]，研究表明其濃度與阿爾茨海默氏癥、肌肉萎縮癥等多種疾病有關(guān)[4 - 5]，因此對(duì)GSH的分析具有重要的意義。目前對(duì)GSH和TA的單組分測(cè)定已有大量研究[6 - 12]，但用電化學(xué)方法對(duì)這兩種物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)分離檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。

碳納米管和石墨烯分別是優(yōu)良的一維和二維碳材料，具有極大的比表面積、良好的導(dǎo)電性以及優(yōu)良的機(jī)械性能等特性[14 - 16]。將石墨烯和碳納米管雜化，它們之間可以產(chǎn)生一種協(xié)同效應(yīng)，使其表現(xiàn)出比任意一種單一材料更加優(yōu)異的性能。本文制備了多壁碳納米管/石墨烯納米片(MWCNTs/GRs)雜化材料，將其修飾在玻碳電極(GCE)上，構(gòu)建了MWCNTs/GRs/GCE。研究了以AP為媒介在MWCNTs/GRs/GCE上GSH和TA的電化學(xué)行為。

GSH在常規(guī)電極上有較高的過(guò)電位和低的電子轉(zhuǎn)移速率使其直接電化學(xué)檢測(cè)困難[13]，因此本文采用間接電化學(xué)法，以乙酰氨基酚(AP)為電催化媒介，實(shí)現(xiàn)在較低電位下測(cè)定GSH，同時(shí)利用GSH和TA在電化學(xué)行為上的差異實(shí)現(xiàn)它們的同時(shí)測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，三電極體系:未修飾和修飾過(guò)的GCE為工作電極，Ag/AgCl|KClsat為參比電極，鉑絲電極為輔助電極；pHS-3C型精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)；KQ-218型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

還原型谷胱甘肽(GSH)、酪胺(TA)購(gòu)自于Sigma有限公司；對(duì)乙酰氨基酚(AP)購(gòu)于百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；多壁碳納米管(MWCNTs)(純度>95%,長(zhǎng)度1～2 μm,直徑20～40 nm)購(gòu)于深圳納米技術(shù)有限公司；石墨烯納米片(6～8 nm厚×5 μm 寬)購(gòu)于Strem化學(xué)品有限公司。其他試劑均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 多壁碳納米管/石墨烯納米片雜化材料制備

用濃H2SO4和濃HNO3(1∶1)組成的混酸分別對(duì)MWCNTs和GRs進(jìn)行氧化處理。實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱(chēng)取一定量的MWCNTs于燒杯中，加入一定量等體積的混酸后超聲振蕩3 h，混合物用二次蒸餾水稀釋?zhuān)o置5 h，倒去上層清液用微孔濾膜真空抽濾，洗至中性，所得的固體于80 ℃真空干燥得到處理后的MWCNTs。選用相同的反應(yīng)條件和步驟得到處理后的GRs。取等量的MWCNTs和GRs分別放入二次蒸餾水中超聲分散1 h，然后把這兩種分散液混合超聲3 h，得到的懸浮液在3 800 r·min-1下離心20 min，倒出上層清夜繼續(xù)離心2次，得到的MWCNTs/GRs于80 ℃真空干燥。

1.3 工作電極的制備

將GCE(3 mm)依次用0.3、0.1、0.05 μm粒徑的Al2O3粉拋光，依次用無(wú)水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗3 min，然后將電極浸入0.5 mol·L-1的H2SO4中，在-1～1 V的電位區(qū)間，以50 mV·s-1的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安掃描直至伏安曲線(xiàn)穩(wěn)定。稱(chēng)取1 mg MWCNTs/GRs加入到1 mL DMF溶液中，超聲分散約0.5 h即得MWCNTs/GRs分散液，取5 μL滴涂到處理好的GCE表面，在空氣中自然晾干得到MWCNTs/GRs/GCE。

1.4 實(shí)際樣品的制備

根據(jù)文獻(xiàn)方法[17]，取等體積的澳牛牛奶和50 mmol·L-1的乙酸溶液混合，在3 000 r·min-1的條件下離心分離20 min,取上清液待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 透射電鏡表征

如圖1所示，采用透射電鏡(TEM)對(duì)酸化后的MWCNTs和MWCNTs/GRs雜化材料進(jìn)行了表征。從圖1(a)可以看出，混酸處理后的MWCNTs長(zhǎng)度較長(zhǎng)，彼此之間會(huì)互相纏結(jié)。圖1(b)為MWCNTs/GRs雜化材料的TEM圖，從圖中可以清晰看出石墨烯有明顯的較薄片層，MWCNTs小部分有團(tuán)聚，大部分嵌插在石墨烯片層中。

2.2 不同工作電極的電化學(xué)特征

考察了GCE(a),GRs/GCE(b),MWCNTs/GCE(c),MWCNTs/GRs/GCE(d)在1 mmol·L-1的[Fe(CN)6]4-/3-+0.5 mol·L-1KCl溶液中的循環(huán)伏安(CV)行為。如圖2所示，曲線(xiàn)a為GCE的CV曲線(xiàn)，其氧化還原峰電位差(ΔEp)為78 mV，曲線(xiàn)b和c分別為GRs/GCE 與MWCNTs/GCE CVs曲線(xiàn)，與曲線(xiàn)a相比ΔEp都減小，峰電流也明顯增大。曲線(xiàn)d為MWCNTs/GRs/GCE的CVs曲線(xiàn)，由曲線(xiàn)d可知，MWCNTs/GRs修飾GCE后ΔEp進(jìn)一步減小，峰電流又進(jìn)一步提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MWCNTs/GRs作為修飾材料可以有效加快電極表面的電子傳遞速率。為進(jìn)一步考察修飾電極的電化學(xué)性能，用交流阻抗法測(cè)定了這4種電極在1 mmol·L-1[Fe(CN)6]4-/3-+0.5 mol·L-1KCl溶液中的交流阻抗圖。如圖2插圖所示，交流阻抗曲線(xiàn)的半徑從大到小依次是GCE>GRs/GCE>MWCNTs/GCE>MWCNTs/GRs/GCE，由此可知MWCNTs/GRs具有優(yōu)良的電化學(xué)性能。

2.3 GSH的電催化氧化行為

在不同條件下，采用CV法研究了AP作為電催化介質(zhì)對(duì)GSH的電催化氧化效果。由圖3可知，GCE(a)和MWCNTs/GRs/GCE(b)在0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.5)中無(wú)氧化還原峰，加入40 μmol·L-1GSH后，GCE(c)和MWCNTs/GRs/GCE(d)在實(shí)驗(yàn)研究的電位范圍內(nèi)也未出現(xiàn)氧化還原峰，說(shuō)明GSH在這兩種電極上無(wú)明顯電化學(xué)響應(yīng)。向上述溶液中加入25 μmol·L-1AP，GCE(e)上出現(xiàn)了氧化峰，MWCNTs/GRs/GCE(g)上出現(xiàn)了明顯的氧化還原峰，說(shuō)明AP在MWCNTs/GRs/GCE上具有良好的電化學(xué)活性。繼續(xù)加入40 μmol·L-1GSH，GCE(f)上氧化峰電流增大，MWCNTs/GRs/GCE(h)上氧化峰電流明顯增大，還原峰電流減小，說(shuō)明在MWCNTs/GRs/GCE上AP對(duì)GSH有明顯的電催化作用。

圖2 不同電極的循環(huán)伏安(CV)曲線(xiàn)(插圖：不同電極的交流阻抗圖)Fig.2 CV curves of different electrodes(Inset:Nyquist plots of different electrodes)solution:1 mmol·L-1[Fe(CN)6]4-/3-+0.5 mol·L-1 KCl;scan rate:100 mV·s-1;frequency range:0.1 - 105 Hz;a.GCE,b.GRs/GCE,c.MWCNTs/GCE,d.MWCNTs/GRs/GCE.

圖3 不同條件下的循環(huán)伏安(CV)曲線(xiàn)Fig.3 CV curves (a) in the absence and(c) presence of 40 μmol·L-1 GSH in 0.1 mol·L-1 PBS (pH=6.5) at GCE.(b) as (a) and(d) as (c) at MWCNTs/GRs/GCE,respectively.CVs of GCE,MWCNTs/GRs/GCE with 25 μmol·L-1 AP(e,g) in the absence and(f,h) presence of 40 μmol·L-1 GSH in 0.1 mol·L-1 PBS(pH=6.5).Scan rate:100 mV·s-1.

2.4 GSH和TA的伏安行為

如圖4所示,采用CV法考察了TA與GSH混合溶液的CV行為。圖中曲線(xiàn)a和曲線(xiàn)b分別代表在GCE和MWCNTs/GRs/GCE上，500 μmol·L-1TA與40 μmol·L-1GSH的混合溶液在10 μmol·L-1AP條件下的CV曲線(xiàn)，可以看到MWCNTs/GRs/GCE(b)上的氧化峰電流比GCE(a)明顯增大，ΔEp也隨之增大。說(shuō)明MWCNTs/GRs能有效地增大電流響應(yīng)，且可以使TA和GSH的氧化峰很好的分離。圖中曲線(xiàn)c是在MWCNTs/GRs/GCE上，500 μmol·L-1TA與40 μmol·L-1GSH的混合溶液在沒(méi)有AP時(shí)的CV曲線(xiàn)，與曲線(xiàn)b相比可知AP對(duì)TA沒(méi)有電催化作用。

2.5 pH的影響

采用CV法考察了溶液pH值對(duì)GSH和TA電化學(xué)行為的影響。如圖5所示，GSH和TA的氧化峰電流均在pH為6.5時(shí)達(dá)到最大值，并且GSH和TA的氧化峰電位差幾乎不受溶液pH值影響，保持在0.3 V左右。故選擇pH=6.5溶液為電解質(zhì)溶液。

2.6 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性

用同一根MWCNTs/GRs/GCE在含40 μmol·L-1GSH，500 μmol·L-1TA和10 μmol·L-1AP的溶液中平行測(cè)定8次，兩個(gè)峰電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.9%和3.7%。用5根同等條件下制備的MWCNTs/GRs/GCE在上述溶液中分別進(jìn)行測(cè)定，RSD分別為4.3%和3.5%。將MWCNTs/GRs/GCE保存在4 ℃冰箱中7 d、14 d和一個(gè)月后，測(cè)得兩個(gè)峰電流分別為初始電流的93.4%、92.8%，90.7%、90.1%和87.5%、88.3%。以上結(jié)果說(shuō)明該電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

在500 μmol·L-1TA與40 μmol·L-1GSH的混合溶液存在10 μmol·L-1AP條件下，考察了一些常見(jiàn)干擾物對(duì)GSH和TA測(cè)定的干擾。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5倍濃度的抗壞血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸和氧化型谷胱甘肽對(duì)GSH和TA的電流響應(yīng)均小于±5%，因此MWCNTs/GRs/GCE具有良好的選擇性。

圖4 GSH和TA在GCE(a)和MWCNTs/GRs/GCE(b)上的循環(huán)伏安(CV)曲線(xiàn)Fig.4 CV curves of 40 μmol·L-1 GSH and 500 μmol·L-1 TA in the presence of 10 μmol·L-1 AP in 0.1 mol·L-1 PBS(pH=6.5) at GCE(a) and MWCNTs/GRs/GCE(b).CV curves of 40 μmol·L-1 GSH and 500 μmol·L-1 TA in 0.1 mol·L-1 PBS(pH=6.5) at MWCNTs/GRs/GCE(c).Scan rate:100 mV·s-1

圖5 pH與氧化峰電流和氧化峰電位的關(guān)系Fig.5 The effect of pH on anodic peak current and peak potential difference for 25 μmol·L-1 GSH and 500 μmol·L-1 TA in the presence of 10 μmol·L-1 AP in 0.1 mol·L-1 PBS at MWCNTs/GRs/GCE.Scan rate:100 mV·s-1

圖6 (A)不同濃度GSH的差分脈沖伏安(DPV)圖(插圖為GSH峰電流與其濃度的關(guān)系曲線(xiàn));(B)不同濃度TA的DPV圖(插圖為T(mén)A峰電流與其濃度的關(guān)系曲線(xiàn));(C)不同濃度GSH和TA的DPV圖(插圖分別為GSH(a)和TA(b)峰電流與其濃度的關(guān)系曲線(xiàn))Fig.6 (A)DPVs of GSH determination,from a to g:0.75,2.5,4.0,8.0,12.5,16.0,20.0 μmol·L-1 GSH in 0.1 mol·L-1 pH=6.5 PBS containing 10 μmol·L-1 TA and 5 μmol·L-1 AP at MWCNTs/GRs/GCE(Inset:plots of the peak current vs.GSH concentration);(B) DPVs of TA determination,from a to g:2.5,25.0,50.0,62.0,85.0,110.0,125.0 μmol·L-1 TA in 0.1 mol·L-1 pH=6.5 PBS containing 0.75 μmol·L-1 GSH and 5 μmol·L-1 AP at MWCNTs/GRs/GCE(Inset:plots of the peak current vs.TA concentration).(C) DPVs of GSH and TA determination for different concentrations of GSH(μmol·L-1) and TA(μmol·L-1):a 0.75,2.5;b 2.5,25.0;c 8.0,40.0;d 11.0,60.0;e 13.0,80.0;f 15.0,100.0;g 20.0,125.0 in 0.1 mol·L-1 pH=6.5 PBS containing 5 μmol·L-1 AP at MWCNTs/GRs/GCE(Inset:plots of the peak current vs.GSH concentration(a) and TA concentration(b))

2.7 GSH和TA的定量分析

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)GSH和TA進(jìn)行定量分析。圖6(A)為T(mén)A和AP保持固定濃度，GSH濃度從0.75～20 μmol·L-1變化時(shí)的DPV曲線(xiàn)。如圖所示，TA的氧化峰電流幾乎不變，GSH的氧化峰電流與其濃度呈線(xiàn)性關(guān)系:Ip(μA)=-0.4103-0.0454c(μmol·L-1),相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9920，線(xiàn)性范圍為0.75～20 μmol·L-1，檢測(cè)限(S/N=3)為0.16 μmol·L-1。圖6(B)為GSH和AP保持固定濃度，TA濃度從2.5～125 μmol·L-1變化時(shí)的DPV曲線(xiàn)。如圖所示，GSH的氧化峰電流幾乎不變，TA的氧化峰電流與其濃度呈線(xiàn)性關(guān)系:Ip(μA)=-0.2245-0.0144c(μmol·L-1),R2=0.9970，線(xiàn)性范圍為2.5～125 μmol·L-1，檢測(cè)限(S/N=3)為0.94 μmol·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在溶液中共存時(shí)可選擇性測(cè)定GSH和TA。圖6(C)是在MWCNTs/GRs/GCE上不同濃度GSH和TA共存下的DPV曲線(xiàn)。GSH和TA的氧化峰電流與其對(duì)應(yīng)濃度均呈線(xiàn)性關(guān)系:Ip(μA)=-0.4899-0.0454c(μmol·L-1),R2=0.9900，(GSH:0.75～20 μmol·L-1);Ip(μA)=-0.2278-0.0135c(μmol·L-1),R2=0.9988，(TA:2.5～125 μmol·L-1);計(jì)算得檢測(cè)限(S/N=3)分別為0.15 μmol·L-1和0.92 μmol·L-1。綜上實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，在GSH和TA共存時(shí)單一測(cè)定與同時(shí)測(cè)定時(shí)所得工作曲線(xiàn)的靈敏度和檢測(cè)限都相差不大，進(jìn)一步說(shuō)明該方法可以同時(shí)測(cè)定溶液中GSH和TA的含量。

2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

在MWCNTs/GRs/GCE上對(duì)澳牛牛奶中GSH和TA的含量進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，回收率為92.0%～101.6%，表明該方法的靈敏度和準(zhǔn)確度較高。

表1 牛奶中GSH和TA的測(cè)定(n=4)

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了MWCNTs/GRs/GCE，并實(shí)現(xiàn)了GSH和TA的同時(shí)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AP對(duì)GSH有良好的電催化作用。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用DPV法測(cè)得GSH和TA的氧化峰電流與其濃度分別在濃度范圍0.75～20 μmol·L-1和2.5～125 μmol·L-1內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限(S/N=3)分別為0.15 μmol·L-1和0.92 μmol·L-1。將該方法應(yīng)用于牛奶中GSH和TA含量測(cè)定結(jié)果滿(mǎn)意。