陳建愛，陳為京，劉鳳吉

1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究所/農(nóng)產(chǎn)品研究所/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100；

2. 山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室，山東 濟南 250100；

3. 山東省臨沂市莒南縣農(nóng)業(yè)局，山東 莒南 276600

花生（Arachis hypogaea L.）是中國重要的油料、經(jīng)濟和出口創(chuàng)匯作物，山東省花生良種良法配套技術(shù)一直處于國內(nèi)領(lǐng)先水平（萬書波，2003）?；ㄉ∈腔ㄉB作減產(chǎn)的主要原因或誘因（徐瑞富等，2003），其根腐病病原菌以鐮刀菌（Fusarium spp.）為主。相關(guān)化學(xué)農(nóng)藥，通過處理土壤、拌種、灌根或淋灑病株等多種方式防治花生根腐病取得了較好的效果。然而，連作及鐮刀菌的積累，使發(fā)病率成倍增加，即使加大藥量和頻繁用藥，鐮刀菌抗藥性也在逐漸增強，病區(qū)從零星生長擴大為重病田（沈其益，1992）；鐮刀菌也侵染花生莢果，導(dǎo)致品質(zhì)下降（孟憲曾，1985；武維華，2008），甚至籽粒產(chǎn)生真菌毒素（GB 4789.16—2016）。真菌毒素和農(nóng)藥殘留造成環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品污染（GB 2762—2017），通過食物鏈危及人類健康。因而，研發(fā)多功能生態(tài)型菌劑，對防治花生根腐病具有重要意義。

利用拮抗微生物防治鐮刀菌的研究已引起人們關(guān)注，例如叢枝菌根 （Arbuscular mycorrhizae）真菌防治西瓜枯萎病（李敏等，2004），淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）次生代謝物質(zhì)抑制尖鐮刀菌（Bacillus）的孢子萌發(fā)與菌落生長（李芳等，2005），芽孢桿菌通過營養(yǎng)競爭等方式防治鐮刀菌（喻國輝等，2010）。木霉（Trichoderma spp.）是國際上公認的防治土傳病害的重要生防因子，目前已商品化并得到應(yīng)用，研究表明，木霉對土傳病菌具有競爭作用、重寄生作用、抑菌作用（Harman，2000；Sharon et al.，2007；馬佳等，2014；Jaiswal et al.，2015；張量等，2015；Gloria et al.，2015；Radwan et al.，2017；Ganuza et al.，2018），能誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)和局部抗病性（Harman et al.，2004）。花生根腐病加重的原因是鐮刀菌等病原菌在土壤內(nèi)富集，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變、區(qū)系失衡（封海勝等，1993；吳宇佳等，2017），若在土壤中接種有益微生物，就能控制病原菌增殖（張志紅等，2011；古麗君等，2013），提高土居微生物數(shù)量（燕嗣皇等，2005），恢復(fù)連作花生土壤生態(tài)平衡。本研究從鐮刀菌的侵染特點分析其致病性，利用黃綠木霉（T. aureoviride）T1010菌劑進行生物防治試驗，旨在探討黃綠木霉T1010對花生根腐病鐮刀菌在土壤中的作用方式、抑菌機理，尋找環(huán)保而有效的防治鐮刀菌的藥劑和合理的防治措施，為防治花生根腐病提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌

花生根腐病鐮刀菌菌株 F1為尖鐮刀菌（Fusarium oxysporum），菌株F2、F4、F7為茄腐皮鐮刀菌（F. solani）不同生物型菌株（陳為京等，2018），F(xiàn)6為木賊鐮刀菌（F. equiseti）。標(biāo)樣采自山東省臨沂市莒南縣花生根腐病嚴重地塊同一棵花生，以常規(guī)分離法和科赫氏法則分離病菌并明確其致病性；單孢分離純化貯存；孢子懸液濃度為107cfu?mL-1，發(fā)酵物為 5×107cfu?g-1。

1.1.2 生防菌

黃綠木霉菌株（Trichoderma aureoviride）T1010，發(fā)酵物孢子濃度為1×109cfu?g-1，為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究所農(nóng)業(yè)微生物實驗室選育；哈茨木霉（T. harzianum）T22菌劑（根部型），有效成分含量為 3×108cfu?g-1，購自北京科威拜沃生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 花生品種

花育 22號（山東省花生研究所繁育，用于盆栽），?；?號（購買，用于區(qū)試）。

1.2 方法

1.2.1 鐮刀菌致病盆栽試驗

盆栽試驗分3種方法：（1）蘸根接種法：待花生小苗長出4片真葉，選取株型一致的幼苗剪去根尖5 mm，分別在鐮刀菌菌株F1、F2、F4、F6、F7、混合株菌液（孢子含量為107cfu?mL-1）中浸泡4 h后移栽入盆，每盆5棵；對照為清水；（2）浸種接種法：將花生籽在鐮刀菌菌液（同上）中浸泡12 h以上（過夜），對照清水浸泡，每盆播種花生籽10粒；（3）土壤接種法：將鐮刀菌發(fā)酵物分別與土壤混合（與土壤質(zhì)量比例為1∶100，干土中鐮刀菌的孢子量為5×105cfu?g-1），對照不加病菌，每盆播種花生籽10粒。各種方法每處理設(shè)置5個重復(fù)。于2016年5月、7月、8月連續(xù)種植3茬，花生苗感病計數(shù)；地點在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田。

花生根腐病的分級標(biāo)準(zhǔn)，以病變根系占全部根系之比劃分病級：0級，無病；1級，根系稍有變色，變色根系占全部根系的10%以下，植株不萎蔫；3級，根系明顯變褐，變色根系占全部根系的10.1%～30%，植株開始萎蔫；5級，變色根系占全部根系的30.1%～50%，植株明顯萎蔫；7級，變色根系占全部根系的50.1%～80%，植株萎蔫；9級，全株枯死。

感病(或病情)指數(shù)=(∑各級發(fā)病數(shù)×相應(yīng)級嚴重度平均值)(調(diào)查總數(shù)×最高發(fā)病級數(shù))-1×100

1.2.2 生防菌防病盆栽試驗

（1）防病促芽試驗：時間為2016年，共設(shè)計5個病菌菌株、混合菌株和黃綠木霉T1010發(fā)酵物+單病菌菌株共12個處理。接種黃綠木霉T1010發(fā)酵物+F. spp.，鐮刀菌和T1010土壤中分生孢子量分別為 5×105cfu?g-1和 105cfu?g-1；每盆播種花生籽 10粒，每處理5盆，連續(xù)種植3茬（接種方法同1.2.1），花生苗病情計數(shù)。（2）防病促生長試驗：4個處理：F（鐮刀菌混合株），T1010+F，T22+F，對照+F。5株鐮刀菌混合發(fā)酵物與土壤混合（與土壤質(zhì)量比例為 1∶100，鐮刀菌的孢子量為 5×105cfu?(g-1干土)），同時分別混合黃綠木霉 T1010發(fā)酵物、哈茨木霉T22菌劑（與土壤質(zhì)量比例分別為1∶10000和 1∶1000，木霉的分生孢子量為 105cfu?g-1），常規(guī)處理肥料也作為基肥加入，每盆播種花生種子 4粒，每處理4盆，重復(fù)4次。苗期計算出苗率、成苗率，結(jié)莢期及飽果期記錄花生生物性狀及病情。

1.2.3 田間防病試驗

試驗時間為2016年、2017年，地點在山東省臨沂市莒南縣丘陵中產(chǎn)田，試驗地土壤基本理化性質(zhì)如下：有機質(zhì) 8.77 g?kg-1，堿解氮 87.16 mg?kg-1，有效磷 57.37 mg?kg-1，速效鉀 106.5 mg?kg-1。設(shè)置 4個處理：空白對照，黃綠木霉T1010發(fā)酵物，哈茨木霉T22菌劑，常規(guī)對照。每小區(qū)面積為6.67×10-3hm2，雙行覆膜播種，每穴播2粒，每公頃播105000穴，3次重復(fù)，共12個小區(qū)。復(fù)合肥公頃施750 kg，黃綠木霉T1010發(fā)酵物、哈茨木霉T22菌劑各公頃施 15 kg，種植花生前，將肥料作為基肥施入。其他時間常規(guī)管理。苗期，以植株存活數(shù)和穴數(shù)計算墩出苗率、墩成苗率，飽果期記錄病情，每小區(qū)隨機選取2 m，測定產(chǎn)量。

田間病情分級標(biāo)準(zhǔn)，按花生葉片萎蔫劃分病級：0級，植株不萎蔫；1級，少量葉片表現(xiàn)可恢復(fù)性萎蔫；3級，葉片10.1%～30%萎蔫，葉仍綠色；5級，葉片30.1%～50%明顯萎蔫；7級，植株萎蔫，葉片50.1%～80%變黃萎蔫，根莖部變褐色；9級，全株枯死，根部腐爛。

1.2.4 土壤中鐮刀菌種群密度測定試驗

花生飽果期，盆栽和小區(qū)試驗取表層土以下5～10 cm土壤，采用土壤稀釋平板法和Martin培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌，26 ℃霉菌培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)7～10 d，依據(jù)鐮刀菌形態(tài)記錄鐮刀菌菌落數(shù)（Booth，1971）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用SAS統(tǒng)計軟件（Version 8.2）整理數(shù)據(jù)，比較黃綠木霉T1010發(fā)酵物對鐮刀菌的防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮刀菌侵染花生致根腐病

2.1.1 蘸根接種

花生育苗生長整齊，葉綠色，主根白色、粗壯；去根尖浸泡鐮刀菌菌液4 h后移栽，花生緩苗慢、生長慢，15 d后95%以上花生苗發(fā)病致萎蔫（表1），根變褐、變黑，病情級數(shù) 5～9級居多，大多數(shù)沒生側(cè)根。對照處理小苗很少發(fā)病，感病指數(shù)為4.59，生長正常、葉盛根白，產(chǎn)生大量側(cè)根且比主根長?；旌现晔够ㄉ虏乐?，感病指數(shù)高達72.15（表1）。發(fā)病嚴重程度為：混合株＞F7＞ F2＞F1＞F4＞F6＞清水對照。幼根傷口為鐮刀菌侵入植株提供通道，可加快鐮刀菌進入維管束系統(tǒng)定殖、增殖并堵塞導(dǎo)管使根變褐、發(fā)黑，導(dǎo)致花生植株萎蔫、枯死。

表1 鐮刀菌菌株蘸根接種致花生根腐病Table 1 Fusarium strains were inoculated through dipping root into peanut to cause root rot

2.1.2 浸種接種

花生籽浸泡鐮刀菌菌液后再播種，出苗慢，有的籽不發(fā)芽，有的發(fā)芽但胚根生長彎曲、有褐斑且萎縮，花生出苗情況最好的是對照（表 2），出苗率為72.67%，混合株浸種組出苗最差，出苗率僅為13.33%，出苗情況表現(xiàn)為：清水對照＞F6＞F4＞F2＞F1＞F7＞混合株。與對照組相比，處理組的植株矮小、發(fā)?。ū?），病情級數(shù)以5級居多，成株發(fā)病嚴重程度為：混合株＞F2＞F1＞F7＞F4＞F6＞清水對照；鐮刀菌混合株接病組主根細短，最短僅為8.73 cm，側(cè)根稀少，根褐色或變黑，對照主根長達29.50 cm（表 2），主根長度為：清水對照＞F6＞F4＞F7＞F2＞F1＞混合株?；ㄉ缙?，鐮刀菌菌絲隨花生萌發(fā)從胚根侵入而進入維管束，花生生長過程中，鐮刀菌菌絲在維管束內(nèi)寄生生長并大量增殖，導(dǎo)致花生導(dǎo)管堵塞，根變褐，花生葉片萎蔫甚至死亡。

2.1.3 土壤接種

土壤接種鐮刀菌菌體后播種花生，鐮刀菌影響花生種子萌發(fā)，花生出苗率最低的是混合株處理組，比清水對照少發(fā)芽56.08%（表3）。不同鐮刀菌菌株對花生的危害程度不同，菌株 F2處理的花生籽出苗率最低，為46.67%，菌株F4、F6對花生出苗率影響較??；鐮刀菌影響花生生長，混合株組花生成苗率低于70%，其他處理成苗率都高于95%?；ㄉ芍晷誀顪y定結(jié)果表明，各處理發(fā)病率不同，混合處理100%發(fā)?。ū?）。各處理花生植株的主根、側(cè)根、根瘤的生長發(fā)育不同（表 3），主根長度為：清水對照＞F6＞F1＞F4＞F7＞F2＞混合株，發(fā)病最嚴重混合株處理組花生主根比清水對照短72.74%，各處理之間差異極大（方差分析，P=0.001）；側(cè)根長度為：清水對照＞F2＞F6＞F1＞F7＞F4＞混合株，發(fā)病最嚴重的混合株處理組花生側(cè)根比清水對照短96.10%，各處理之間存在差異（方差分析，P=0.001）；側(cè)根數(shù)量為：清水對照＞F6＞F2＞F1＞F4＞F7＞混合株，發(fā)病最嚴重的混合株處理組花生側(cè)根數(shù)比清水對照少97.17%，各處理之間存在顯著差異（方差分析，P=0.001）；根瘤數(shù)量為：清水對照＞F6＞F2＞F7＞F4＞F1＞混合株，發(fā)病最嚴重混合株處理組花生根瘤數(shù)比清水對照降低95.53%，各處理之間差異顯著（方差分析，P=0.001）。土壤具有抑菌作用，同時土壤顆粒分散鐮刀菌種群密度，使花生籽接觸鐮刀菌菌絲數(shù)量減少，提高了花生發(fā)芽率，但隨鐮刀菌在土壤中的定殖、增殖，鐮刀菌菌絲逐步侵染花生致病，影響花生的生長。

表2 鐮刀菌菌株浸種接種致花生根腐病Table 2 Fusarium strains were inoculated through soaking seed into peanut to cause root rot

表3 鐮刀菌菌株土壤接種對花生生長的影響Table 3 Fusarium strains were inoculated into soil and peanut was inhibited to grow

2.2 黃綠木霉T1010對花生根腐病防治效果

2.2.1 黃綠木霉T1010防治鐮刀菌促花生發(fā)芽

土壤接種鐮刀菌，生防組同時接種黃綠木霉T1010發(fā)酵物后種植花生，鐮刀菌混合株、菌株F2組花生發(fā)芽率低于50%（圖1）。黃綠木霉T1010處理組花生苗整齊，葉綠，根系發(fā)達、主根長，側(cè)根生長規(guī)則整齊，為三列或四列一級側(cè)根；鐮刀菌處理組的花生苗陸續(xù)死亡，存活的植株根系弱，側(cè)根少且生長不規(guī)則，褐色，病情級數(shù)高達7級。黃綠木霉 T1010處理組成株花生防病效果 73.79%以上。土壤中鐮刀菌數(shù)量病菌組和生防組t檢驗均達顯著差異（圖1，F(xiàn)1，P=0.001；F2，P=0.004；F4，P=0.001；F6，P=0.001；F7，P=0.002；混合株，P=0.003），土壤中鐮刀菌數(shù)量F7組達到6.10×104cfu?g-1，F(xiàn)1、F4 組達到 4.13×104cfu?g-1和 3.80×104cfu?g-1，黃綠木霉 T1010菌劑的處理組土壤中鐮刀菌種群密度低（圖 2）。初步試驗表明，黃綠木霉T1010發(fā)酵物處理土壤抑制鐮刀菌的生長和繁殖，控制鐮刀菌在土壤中的種群數(shù)量，降低花生發(fā)芽時鐮刀菌對花生胚及根侵染，防治花生根腐病。

圖2 鐮刀菌及T1010+鐮刀菌不同處理土壤中鐮刀菌的數(shù)量Fig. 2 The number of Fusarium in soil with Fusarium or Fusarium and Trichoderma strain T1010

2.2.2 黃綠木霉 T1010防治鐮刀菌促進花生生長發(fā)育

鐮刀菌混合株接種土壤后種植花生，鐮刀菌抑制花生發(fā)芽，不同處理花生出苗不同（表 4），T1010+F組出苗率比 F組提高 24.00%，比 CK+F組提高9.00%；F組花生出苗不一致、苗弱、葉黃、高矮不齊，T1010+F組花生籽粒出苗齊、苗壯，成苗率高（表4），比F組提高32.66%，比CK+F組提高18.51%?；ㄉ_花下針期，T1010+F組花生開花多，入土果針多，果針入土深，主根長是F組的1.73倍，側(cè)根數(shù)提高數(shù)倍，根瘤在主根和側(cè)根近主根處多，根瘤體積大，有效根瘤多。花生結(jié)莢期，病情指數(shù)分析顯示，T22、T1010、CK分別比F組降低60.29%、79.16%、39.62%（表4）?；ㄉ柟谌⊥潦覂?nèi)進行土壤鐮刀菌培養(yǎng)，各處理差異顯著（F=30.94，P=0.001）（表4），F(xiàn)組土壤中鐮刀菌種群數(shù)量為 1.02×104cfu?g-1，T1010+F組鐮刀菌種群數(shù)量只有F組的3.62%。盆栽試驗表明，黃綠木霉 T1010發(fā)酵物處理土壤控制了鐮刀菌種群的擴大，阻止了鐮刀菌侵染花生根及對花生生長發(fā)育的影響。

表4 黃綠木霉T1010菌劑對花生鐮刀菌根腐病防治效果Table 4 The effect of in pot soils treated with Trichoderma aureoviride 1010 controlled peanut Fusarium root rot in pot soil trail

2.2.3 黃綠木霉T1010防治花生根腐病促增產(chǎn)

田間小區(qū)試驗表明，花生苗期各處理出苗差別不大，開花下針期各處理花生病情開始出現(xiàn)差異（表5），有的處理花生葉片淺綠，開花少，根變褐、側(cè)根少或無側(cè)根、果針少，T1010組的花生生長茂盛，枝壯葉綠、整齊，花多、花期集中，根系發(fā)達，病株顯著低于其他處理，發(fā)病率分別比空白和常規(guī)對照降低64.57%、38.10%。飽果期各處理組發(fā)病差別明顯（表5），空白對照組花生大面積葉片萎蔫、枯萎至死亡，根腐病嚴重，病情級數(shù)5級居多，高達9級，而T1010組花生根腐病發(fā)生少，發(fā)病率比空白對照降低 94.67%，與對照相比防病效果為88.96%，產(chǎn)量增產(chǎn)38.57%（表5）；對耕層土壤鐮刀菌種群分析，各處理差異顯著（F=80.77，P=0.001）（表 5），常規(guī)對照組鐮刀菌數(shù)量達到 3.40×104cfu?g-1，而 T1010組土壤鐮刀菌數(shù)量少，只有常規(guī)對照組的2.62%。田間試驗表明，黃綠木霉T1010菌劑極大降低了土壤鐮刀菌種群密度，控制了花生根腐病的大面積發(fā)生。

3 討論

黃綠木霉T1010可通過消減土壤中鐮刀菌的種群密度防治花生根腐病。病害的迅速增長有賴于病原物群體的迅速增長，鐮刀菌作為土壤習(xí)居菌在土壤中出現(xiàn)的頻率較大（Booth，1971），種群數(shù)量是發(fā)病第一要素（李君彥等，1987；沈其益，1992），鐮刀菌成為土壤優(yōu)勢菌控制了土壤使作物長期致?。ㄐ烊鸶坏?，2003；封海勝等，1993）。本試驗中，鐮刀菌接種數(shù)量為5×105cfu?g-1時，花生苗期開始發(fā)病，病菌從根部侵染到莖，進而出現(xiàn)花生大面積萎蔫、枯死；飽果期根腐病嚴重地塊中 1g土樣所含的鐮刀菌數(shù)量可達3.4×104cfu，占土壤真菌數(shù)量的 3%～17%（1 g土壤中可含 5×105～ 10×105個真菌）；反之，當(dāng)鐮刀菌種群數(shù)量減到一定量時便失去群體效應(yīng)。本試驗中，施用黃綠木霉T1010后鐮刀菌種群數(shù)量減到8.9×102cfu?g-1以下，未發(fā)生根腐病。

黃綠木霉T1010可通過促進花生根系生長限制鐮刀菌的侵入。真菌侵入寄主需要一定的途徑，最容易的途徑是傷口、自然孔口等現(xiàn)成的侵入通道，鐮刀菌入侵以傷口為主要形式（張亮，2016）。本試驗也證明了花生根尖受傷后接種鐮刀菌比種子接種的花生萎蔫快、死亡快。試驗結(jié)果顯示，黃綠木霉T1010施入土壤后，具有同其他有益微生物相同的作用，可促進花生生長發(fā)育（李勤奮等，2012），誘導(dǎo)花生產(chǎn)生系統(tǒng)和局部抗病性（Harman et al.，2004），降低花生根傷口數(shù)量，消減了傷口的危害，限制了鐮刀菌的侵入，防病效果顯著，這與黃綠木霉T1010在土壤上施用提高花生抗鹽堿性效果相似（陳建愛等，2014）。

表5 黃綠木霉T1010發(fā)酵物防治花生根腐病小區(qū)試驗Table 5 Trichoderma aureoviride strain T1010 controlled peanut root rot in the plot experiment

黃綠木霉 T1010對鐮刀菌的生物防治具有廣譜性。鐮刀菌對作物危害大，多菌株共同致病是花生減產(chǎn)的主要致病菌（徐瑞富等，2003）。鐮刀菌變異種類多（Booth，1971），本試驗中所用5株不同生物型鐮刀菌菌株為一株花生上分離所得，并具有互作效應(yīng)，鐮刀菌混合株比鐮刀菌單株致病性強，侵染花生時間不同，試驗初步發(fā)現(xiàn)，尖鐮刀菌 F1在花生苗期發(fā)病多，茄腐皮鐮刀菌F2、F4、F7在花生開花后發(fā)病嚴重，木賊鐮刀菌F6結(jié)莢后發(fā)病重，這部分試驗還需要專門深入研究和論證。木霉和鐮刀菌同為土壤習(xí)居真菌，其在土壤及作物根際中的密度決定其領(lǐng)先地位和拮抗關(guān)系，可利用土壤微生物互相制約，通過提高土壤中木霉等有益菌數(shù)量限制鐮刀菌的數(shù)量（Harman，2000；李敏等，2004；燕嗣皇等，2005；張志紅等，2011；古麗君等，2013；趙麗婭等，

2015）。

4 結(jié)論

試驗結(jié)果顯示，黃綠木霉 T1010菌劑施用后對連作地塊花生根腐病防病效果顯著，同時顯示，黃綠木霉 T1010對不同的鐮刀菌都具有防治效果，表現(xiàn)出生防效果的廣譜性，這是目前推廣使用的化學(xué)農(nóng)藥難以實現(xiàn)的。