劉新，王芳, ，江和龍，姚宗豹*

1. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；

2. 中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所/湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008

氮、磷營(yíng)養(yǎng)元素的過(guò)度輸入會(huì)提高受納水體的營(yíng)養(yǎng)水平，從而導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，富營(yíng)養(yǎng)化是目前水生生態(tài)系統(tǒng)面臨的重要環(huán)境問(wèn)題之一。富營(yíng)養(yǎng)化的負(fù)面影響包括藍(lán)藻水華（Heisler et al.，2008）、破壞食物網(wǎng)（Capriulo et al.，2002）和導(dǎo)致水體缺氧（Diaz et al.，2008）。氮（N）是引起水生生態(tài)系統(tǒng)富營(yíng)養(yǎng)化的主要元素之一，減少外部氮輸入和控制內(nèi)部氮負(fù)荷對(duì)降低水生態(tài)系統(tǒng)富營(yíng)養(yǎng)化水平至關(guān)重要（Conley et al.，2009；薄濤等，2017）。

沉積物是富營(yíng)養(yǎng)化湖泊氮的重要來(lái)源之一，當(dāng)?shù)耐庠摧斎氲玫娇刂坪?，沉積物內(nèi)源氮負(fù)荷對(duì)水環(huán)境的影響將逐漸顯現(xiàn)。只有同時(shí)控制外源氮輸入和削減內(nèi)源氮釋放才能逐漸改善富營(yíng)養(yǎng)化湖泊的營(yíng)養(yǎng)水平（Burger et al.，2007）。沉積物中涉氮微生物過(guò)程是無(wú)機(jī)氮遷移轉(zhuǎn)化的重要途徑，如反硝化和厭氧氨氧化（Anammox），可以將無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)忉尫诺酱髿庵?，從而?shí)現(xiàn)沉積物氮的去除，改善水環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)水平（Trimmer et al.，2009；陳重軍等，2014）。最近研究發(fā)現(xiàn)，除了反硝化和厭氧氨氧化過(guò)程，厭氧鐵氧化氨過(guò)程（Feammox）也可以在厭氧條件下將氨氧化為N2，實(shí)現(xiàn)氮的去除。該過(guò)程是耦合三價(jià)鐵還原和氨厭氧氧化，在Fe(Ⅲ)被還原為Fe(Ⅱ)的同時(shí)，N被氧化為N2（Ding et al.，2014；Yang et al.，2012）、N（Clément et al.，2005；Huang et al.，2015；Sawayama，2006）或N（Yang et al.，2012；Li et al.，2018；Weng et al.，2017）。Feammox是一種微生物過(guò)程，鐵還原速率與鐵還原菌（FeRB）豐度有顯著的相關(guān)性（Ding et al.，2017；Li et al.，2015），Huang et al.（2015）報(bào)道稱，Acidimicrobiaceae A6能夠催化Feammox過(guò)程，將N氧化為。

研究人員已經(jīng)在多種環(huán)境中發(fā)現(xiàn) Feammox過(guò)程，如水稻田土壤（Ding et al.，2014；Zhou et al.，2016）、河岸帶沉積物（Clément et al.，2005；Ding et al.，2017；Park et al.，2009；丁幫璟等，2018）、林地土壤（Huang et al.，2015；Yang et al.，2012）、河流沉積物（Huang et al.，2016）以及活性污泥系統(tǒng)（Sawayama，2006；Su et al.，2017；Yang et al.，2018；王亞娥等，2014；吳胤等，2017）。Ding et al.（2014）調(diào)查了水稻田土壤的Feammox過(guò)程，結(jié)果表明水稻田土壤中 Feammox速率為 7.8～61 kg?hm-2?a-1，約占氮肥施用量的 3.9%～31%。Ding et al.（2017）發(fā)現(xiàn)河岸帶沉積物中 Feammox速率為0.20～0.37 mg?kg-1?d-1，占氮肥施用量的 4%～7.3%。Li et al.（2015）等通過(guò)15同位素示蹤結(jié)合乙炔抑制實(shí)驗(yàn)調(diào)查了長(zhǎng)江流域濕地的 Feammox過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn) Feammox能夠?qū)⒀趸癁?N2、或 NAnammox和反硝化過(guò)程能夠?qū)a(chǎn)生的N和轉(zhuǎn)化為N2，實(shí)現(xiàn)氮的去除。

1 材料和方法

1.1 采樣點(diǎn)分布及樣品采集

太湖是一個(gè)富營(yíng)養(yǎng)化的大型淺水湖泊，梅梁灣位于太湖北部，受北部梁溪河、閭江等河道輸入和無(wú)錫市的影響，梅梁灣屬于藻型湖區(qū)，2017年5月梅梁灣所在區(qū)域?yàn)橹卸雀粻I(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，由于入湖污染主要來(lái)自梅梁灣北部，并向南逐漸稀釋擴(kuò)散，水體及沉積物氮磷存在自然梯度，灣內(nèi)濃度高于灣外敞開(kāi)湖區(qū)。因此，在梅梁灣內(nèi)由北向南設(shè)置1#、3#、4#點(diǎn)、5#樣點(diǎn)進(jìn)行研究（圖1），考察梅梁灣沉積物中鐵氧化氨過(guò)程特征。

2017年 5月在各樣點(diǎn)采集樣品，采樣日氣溫27 ℃，水溫24 ℃。采集的沉積物樣品放置在冷藏采樣箱內(nèi)盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。在厭氧手套箱中，將每個(gè)位點(diǎn)的樣品分為3份，第1份保存在4 ℃條件下，用于測(cè)定沉積物的理化性質(zhì)[pH、含水率、TOC、、、、Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)]；第 2 份用于同位素示蹤和乙炔抑制實(shí)驗(yàn)，測(cè)定Feammox速率；第3份保存在-80 ℃條件下，用于分析沉積物微生物特征。

1.2 同位素示蹤實(shí)驗(yàn)

圖1 太湖梅梁灣采樣點(diǎn)分布圖Fig. 1 Map of Meiliang Bay, Lake Taihu showing the locations of sampling sites

同位素示蹤實(shí)驗(yàn)接種在厭氧手套箱中完成，在充有 φ=99.99%氦氣（He）的厭氧手套箱中，將沉積物樣品與厭氧去離子水按照1∶3（m∶V）的比例混合均勻，并在黑暗條件下預(yù)處理36 h，以去除沉積物本底氧氣和。取10 g經(jīng)預(yù)處理后的均質(zhì)泥水混合物置于100 mL血清瓶中，然后進(jìn)行同位素接種。同位素接種實(shí)驗(yàn)分3組：（1）加入?yún)捬跞ルx子水作為對(duì)照組；（2）加入 100 μmol?L-1Cl；（3）加入 100 μmol?L-115NH4Cl+C2H2。血清瓶用橡膠塞和鋁蓋密封。24 h后立即收集15 mL氣體樣品，通過(guò)同位素質(zhì)譜儀（IRMS，Thermo Finnigan Delta V Advantage，Bremen，Germany）測(cè)定、。氣體樣品收集后，立即對(duì)血清瓶?jī)?nèi)的漿液進(jìn)行二次取樣，測(cè)定 Fe(Ⅱ)和 Fe(Ⅲ)濃度變化并核算 Fe(Ⅲ)還原速率（Lovley et al.，1987）。以Cl處理組中的產(chǎn)生速率來(lái)表征Feammox速率（Li et al.，2015）。

1.3 沉積物理化性質(zhì)分析

將沉積物和去離子水以1∶2.5混合后，用pH計(jì)測(cè)量泥水混合物的 pH值來(lái)代表沉積物的 pH。以10 g沉積物在60 ℃下烘至恒重前后的質(zhì)量差來(lái)核算沉積物含水率。沉積物總有機(jī)碳（TOC）用元素分析儀測(cè)定，測(cè)定前沉積物中的碳酸鹽用1 mol?L-1鹽酸去除。沉積物中的活性總鐵（TFe）和活性Fe(Ⅱ)的提取及測(cè)定參考Lovley et al.（1987）的文獻(xiàn)，可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量以活性總鐵和 Fe(Ⅱ)含量的差值來(lái)計(jì)算。

1.4 DNA提取和PCR擴(kuò)增

沉積物樣品（0.25 g）總DNA采用Power Soil DNA試劑盒（MO BIO Laboratories，美國(guó)）提取。DNA純度和濃度采用 Nanodrop-2000分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)）測(cè)定。Li et al.（2015）報(bào)道稱潮間帶濕地 Feammox過(guò)程與鐵還原菌希瓦氏菌（Shewanella spp.）和地桿菌（Geobacteraceae spp.）豐度之間有顯著的相關(guān)性；Huang et al.（2015）通過(guò)短期培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)微酸菌（Acidimicrobiaceae）科的Acidimicrobiaceae A6可能直接參與將氧化為的 Feammox過(guò)程。因此，本研究調(diào)查富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物中希瓦氏菌（Shewanella spp.）、地桿菌（Geobacteraceae spp.）、Acidimicrobiaceae科及Acidimicrobiaceae A6豐度。Shewanella spp.使用的引物為 She 120f（5′-GCC TAGGGA TCT GCC CAG TCG-3′）和 She 220r（5′-CTA GGTTCA TCC AAT CGC G-3′）；Geobacteraceae spp.使用的引物為Geo564f（5′-AAGCGT TGT TCG GAW TTA T-3′）和 Geo840r（5′-GGCACT GCA GG GGT CAA T A-3′）；Acidimicrobiaceae使用的引物為 362f（CGG TCC AGA CTC CTA CGG GA）和 539r（GAC AGG GTT TTA CAG TCC GAA GA）；Acidimicrobiaceae A6使用的引物為342f（GCA ATG GGG GAA ACC CTG AC）和439r（ACC GTC AAT TTC GTC CCT GC）。qPCR擴(kuò)增及相應(yīng)溫度程序參考Somenahally et al.（2011）和 Huang et al.（2016）的文獻(xiàn)，定量結(jié)果為3次測(cè)試的平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，采用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)比不同處理之間的差異性，采用Pearson相關(guān)分析評(píng)價(jià)Feammox、沉積物性質(zhì)、鐵還原菌之間的相關(guān)性；不同處理組數(shù)據(jù)之間的顯著性差異水平設(shè)置為0.05。運(yùn)用Origin 9.2軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物理化性質(zhì)

太湖梅梁灣沉積物理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表1。pH值范圍為7.22～7.62；含水量在52.6%～57.3%之間；可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量在 5.32～6.95 g?kg-1之間；活性 Fe(Ⅱ)含量為 0.74～0.87 g?kg-1；NH4+-N在 0.11～0.16 g?kg-1之間；NOx--N 在 0.03～0.07 g?kg-1之間；TOC在1.18%～2.38%之間。TH04點(diǎn)位的可微生物還原 Fe(Ⅲ)和 TOC含量高于其他采樣點(diǎn)。TH05采樣點(diǎn)的活性Fe(Ⅱ)、TOC低于其他采樣點(diǎn)。TH01采樣點(diǎn)的 NH4+高于 TH03、TH04、TH05采樣點(diǎn)。

2.2 同位素實(shí)驗(yàn)中30N2和29N2產(chǎn)生特征

表1 太湖梅梁灣采樣點(diǎn)沉積物理化特征Table 1 Chemical characteristics of sedimnts of Meiliang bay, Lake Taihu

圖2 對(duì)照實(shí)驗(yàn)、15NH4+和15NH4++C2H2實(shí)驗(yàn)組30N2（a）和29N2（b）產(chǎn)生速率Fig. 2 Mean 30N2 (a) and 29N2 (b) production rates in the control, 15NH4+ and 15NH4+ + C2H2 treatments for the sediments n=3. The same below

2.3 同位素示蹤實(shí)驗(yàn)Fe(Ⅲ)還原速率

同位素示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)測(cè)定沉積物中Fe(Ⅲ)含量變化，核算了 Fe(Ⅲ)還原速率，結(jié)果如圖3所示。只添加的實(shí)驗(yàn)組Fe(Ⅲ)還原速率為 0.23～0.31 g?kg，高于+C2H2實(shí)驗(yàn)組（0.7～0.27 g?kg），兩者均高于相應(yīng)采樣點(diǎn)對(duì)照組的 Fe(Ⅲ)還原速率（0.15～0.19 g?kg-1?d-1）。與實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，在 4個(gè)采樣點(diǎn)中，TH04的 Fe(Ⅲ)還原速率最大，TH05的Fe(Ⅲ)還原速率最小。

圖3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)、和C2H2實(shí)驗(yàn)組Fe(Ⅲ)還原速率Fig. 3 Fe(Ⅲ) reduction rates measured through isotope tracer incubations(control, and+C2H2 experiments)

2.4 富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物中的FeRB豐度

梅梁灣沉積物中希瓦氏菌（Shewanella spp.）、地桿菌（Geobacteraceaespp.）、微酸菌（Acidimicrobiaceae）科及AcidimicrobiaceaeA6的豐度如圖4所示。希瓦氏菌（Shewanella spp.）的基因豐度最高，為 2.98×108～4.02×108copies?g-1（干質(zhì)量，下同）。地桿菌（Geobacteraceaespp.）、微酸菌（Acidimicrobiaceae）科及 Acidimicrobiaceae A6的豐度依次為 2.07×108～2.6×108、0.5×108～0.68×108和 0.22×108～0.33×108copies?g-1。在 4 個(gè)采樣點(diǎn)的沉積物中，TH04采樣點(diǎn)的4種微生物的基因拷貝數(shù)都大于其他采樣點(diǎn)的基因拷貝數(shù)。

3 討論

3.1 富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物中Feammox的發(fā)生

雖然水稻田土壤、河岸帶沉積物、林地土壤、河流沉積物等生態(tài)系統(tǒng)中均存在 Feammox過(guò)程，但是關(guān)于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物中 Feammox過(guò)程特征及其對(duì)氮循環(huán)的貢獻(xiàn)卻鮮有報(bào)道，因此，本研究通過(guò)同位素示蹤結(jié)合乙炔抑制研究了富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物中Feammox過(guò)程及其作用。由于在同位素示蹤前，沉積物本底氧氣、和已經(jīng)被消耗殆盡，因此同位素示蹤實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)生只可能來(lái)自于Feammox過(guò)程中的直接氧化，或者是 Feammox氧化為然后經(jīng) Anammox、反硝化過(guò)程產(chǎn)生 N2。和C2H2實(shí)驗(yàn)組的 Fe(Ⅲ)還原率明顯高于對(duì)照組，表明添加和+C2H2能夠提升Fe(Ⅲ)還原，以上結(jié)果都表明富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物中存在鐵氧化氨作用。此外，只添加實(shí)驗(yàn)組的 Fe(Ⅲ)的還原率與（r=0.815，P＜0.01）和的產(chǎn)生速率（r=0.799，P＜0.01）呈顯著相關(guān)性（圖5），進(jìn)一步表明富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊沉積物中發(fā)生了Feammox過(guò)程。只添加實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)生速率大于實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)生速率，表明Feammox氧化的產(chǎn)物不僅僅是N2，還包括和，F(xiàn)eammox或通過(guò)耦合Anammox和反硝化過(guò)程會(huì)導(dǎo)致富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物的氮損失。

沉積物Feammox過(guò)程受到多個(gè)因素的影響，如可微生物還原Fe(Ⅲ)含量、pH、TOC、微生物群落結(jié)構(gòu)特征等（Li et al.，2015）。Feammox速率與沉積物可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量之間呈明顯正相關(guān)（r=0.648，P＜0.05），表明沉積物可微生物還原 Fe(Ⅲ)含量高的區(qū)域更可能發(fā)生Feammox反應(yīng)，F(xiàn)eammox速率或更高，該結(jié)果與已有的報(bào)道一致（Ding et al.，2017；Li et al.，2015）。同樣地，F(xiàn)eammox 速率與沉積物 TOC 呈顯著相關(guān)性（r=0.906，P＜0.01），Ding et al.（2014）和 Ding et al.（2017）也報(bào)道稱高 TOC含量有助于Feammox的發(fā)生，這可能是由于高TOC會(huì)促進(jìn)黏土礦物釋放鐵氧化物，從而促進(jìn)Feammox反應(yīng)的發(fā)生（Melton et al.，2014）。盡管pH值是調(diào)節(jié)Fe氧化物和鐵氧化還原反應(yīng)的重要因子，但pH值與Feammox速率之間不存在顯著相關(guān)性（r=227，P＞0.05），表明 pH 值對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物中的Feammox反應(yīng)影響不大。

3.2 Fe(Ⅲ)還原速率、Feammox速率、FeRB之間相關(guān)性

異化鐵還原作用會(huì)利用有機(jī)質(zhì)作為電子供體實(shí)現(xiàn) Fe(Ⅲ)還原（Melton et al.，2014），微生物的新陳代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)也會(huì)利用環(huán)境中的 Fe(Ⅲ)（Raiswell et al.，2012），因此 Fe(Ⅲ)的還原速率受多種因素或過(guò)程的影響。在添加的實(shí)驗(yàn)中，外加提升了沉積物Fe(Ⅲ)的還原速率，同時(shí)Fe(Ⅲ)還原速率與（Feammox速率）產(chǎn)生速率之間存在顯著相關(guān)性（圖5），這表明Fe(Ⅲ)還原速率的提升可能主要是由于沉積物中發(fā)生了因外加導(dǎo)致的Feammox過(guò)程。的產(chǎn)生可能來(lái)自于 Feammox氧化沉積物本底14NH4+為，然后厭氧氨氧化菌（AnAOB）利用產(chǎn)生的與生成；亦或是Feammox氧化沉積物本底為，經(jīng)反硝化被還原，AnAOB利用產(chǎn)生的與生成。因此的產(chǎn)生也與Feammox過(guò)程有關(guān)，而且本研究中Feammox與只添加實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)生速率之間呈顯著相關(guān)性（圖5）。

圖5 只添加實(shí)驗(yàn)組中Fe (Ⅲ)還原率與2和產(chǎn)生速率的相關(guān)性Fig. 5 Pearson’s correlations of iron reduction rates with both (a) and (b) production rates in the treatment

FeRB能夠以多種物質(zhì)（如乙酸鹽、乳酸鹽、H2和氨）為電子供體還原 Fe(Ⅲ)（Melton et al.，2014）。Li et al.（2015）發(fā)現(xiàn) Fe(Ⅲ)還原速率和Feammox速率與Geobacteraceaespp.和Shewanellaspp.呈顯著相關(guān)性。同樣地，本研究也發(fā)現(xiàn)Feammox速率與 Geobacteraceae spp.（r=0.735，P＜0.01）和Shewanella spp.（r=0.628，P＜0.05）呈顯著相關(guān)，這表明Geobacteraceaespp.和Shewanellaspp.在富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物的 Feammox過(guò)程中可能起到重要作用。除了Geobacteraceae spp.和Shewanella spp.在Feammox過(guò)程中起到重要作用之外，Huang et al.（2015）通過(guò)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Acidimicrobiaceae科的Acidimicrobiaceae A6在Feammox氧化為的途徑中起到重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn) Feammox速率與 Acidimicrobiaceae（r=0.635，P＜0.05）和Acidimicrobiaceae A6（r=0.644，P＜0.05）有顯著的相關(guān)性。因此，F(xiàn)eammox與FeRB的相關(guān)性分析表明，F(xiàn)eammox的發(fā)生為生物過(guò)程，可能是由FeRB催化發(fā)生，但是具體是哪一種鐵還原菌實(shí)現(xiàn)的，還需要開(kāi)展進(jìn)一步研究。

3.3 Feammox在氮循環(huán)中的作用

Feammox通過(guò)直接氧化 NH4+為 N2，或氧化為、，再耦合Anammox或反硝化將、轉(zhuǎn)化為N2，實(shí)現(xiàn)沉積物中的去除，從而導(dǎo)致氮損失。根據(jù)梅梁灣沉積物的濕體積密度（1.3 g?cm-3）和同位素接種實(shí)驗(yàn)測(cè)得的Feammox速率，估算得到因 Feammox導(dǎo)致的氮損失量約為1.1～2.0 t?km-2?a-1，約占太湖人為氮輸入量（約 21.8 t?km-2?a-1，Gao et al.，2015）的 6.1%～9.4%。研究結(jié)果表明，F(xiàn)eammox過(guò)程是富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物重要的氮匯，在沉積物無(wú)機(jī)氮的去除中起著重要的作用。

4 結(jié)論

研究表明，富營(yíng)養(yǎng)化湖泊沉積物（太湖梅梁灣）中存在Feammox過(guò)程，F(xiàn)eammox通過(guò)直接氧化為 N2，或氧化為、再耦合 Anammox或反硝化將、轉(zhuǎn)化為N2，從而實(shí)現(xiàn)沉積物中的去除。同位素示蹤實(shí)驗(yàn)測(cè)得太湖梅梁灣沉積物中 Feammox 速率為 0.28～0.43 mg?kg-1?d-1，因Feammox導(dǎo)致的氮損失約占太湖人為氮輸入量的6.1%～9.4%，F(xiàn)eammox過(guò)程是太湖梅梁灣沉積物重要的氮匯。FeRB參與了Feammox過(guò)程，對(duì)Feammox過(guò)程的發(fā)生起重要作用。