劉紅梅，周廣帆，李潔，王麗麗，王慧，楊殿林

農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191

降升高是全球變化的重要現象之，導致了土壤酸化、生物多樣性降低等一系列態(tài)環(huán)境問題的出現（Bai et al.，2010；Wei et al.，013；Stevens et al.，2004）。草原是陸地生態(tài)系最重要的組成部分，約占陸地總面積的1/4～1/3劉楠等，2010）。氮沉降增加不僅會對草原植物長產生直接影響（李文姣等，2015），還會通過響土壤微生物對有機質的降解速率和微生物活（Pregitzer et al.，2008；劉紅梅等，2017）而生態(tài)系統(tǒng)的碳氮循環(huán)產生影響（Wei et al.，2012；chimel，2013）。因此，大氣氮沉降持續(xù)增加將會響生態(tài)系統(tǒng)的結構與功能，特別是干旱和半干的草地生態(tài)系統(tǒng)。壤酶是

土壤的重要組分，主要來自微生物、物和動物的活體或殘體，參與土壤的生物化學過。土壤酶活性作為土壤微生物群落活性表征指標一（Alvarez et al.，2000），被廣泛用于評價土壤養(yǎng)物質循環(huán)轉化狀況和評價肥料施用的效果（和祥等，2010）。土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶等水酶活性能夠表征土壤氮、磷、碳等養(yǎng)分的循環(huán)狀況，多酚氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等氧化酶活性與土壤腐殖化過程、生物呼吸強度緊密相關（林先貴，2010）。國內外關于氮沉降對陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤酶活性已開展了一些研究，但在不同生態(tài)系統(tǒng)中，土壤酶活性對氮沉降增加的響應有所不同。一些研究表明，氮沉降促進了土壤脲酶（劉星等，2015；Wang et al.，2008）、多酚氧化酶活性（張藝等，2017）；而另一些研究表明，氮沉降增加抑制了脲酶（孫亞男等，2016；Wang et al.，2014；蘇潔瓊等，2014）、過氧化物酶、蔗糖酶活性（劉星等，2015）?？傊两祷虻砑訉ν寥浪饷负脱趸富钚缘挠绊懸蛑脖活愋?、土壤養(yǎng)分有效性、氮添加量和氮添加時間長短不同而存在明顯差異。目前，關于氮沉降或氮添加對荒漠化草原（蘇潔瓊等，2014）、典型草原（閆鐘清等，2017）、高寒草甸（孫亞男等，2016）研究較多，而對長期氮沉降對溫帶草甸草原土壤水解酶和氧化酶活性的研究較少。

貝加爾針茅（Stipa baicalensis）草原是亞洲中部草原區(qū)所特有的草原群系，是草甸草原的代表類型之一。為揭示氮沉降增加對中國北方溫帶草甸草原的影響，本研究以內蒙古貝加爾針茅草原為研究對象，探討不同氮沉降水平下土壤脲酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶和蔗糖酶活性的變化趨勢及其與土壤化學性質的相關性，對其可能的影響機制進行了初步的分析與討論，為全球變化背景下草原生態(tài)系統(tǒng)的科學管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域位于內蒙古鄂溫克自治旗，地理位置為北緯 48°27′～48°35′，東經 119°35′～119°41′。半干旱大陸性季風氣候，年均氣溫-1.6 ℃，年降水量328.7 mm，無霜期113 d。植被類型為貝加爾針茅（Stipa baicalensis）草甸草原，貝加爾針茅為建群種，羊草（Leymus chinensis）為優(yōu)勢種。羽茅（Achnatherum sibiricum）、線葉菊（Filifoliumsibicum）、草地麻花頭（Serratulay amatsutanna）、扁蓿豆（Melissitus ruthenica）、日蔭菅（Carex pediformis）、裂葉蒿（Artemisia tanacetifolia）、變蒿（Artemisia commutata）、狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium）、多莖野豌豆（Vicia multicaulis）、祁州漏蘆（Rhaponticum uniflorum）、寸草苔（Carexduriuscula）、腎葉唐松草（Thaictrum petaloideum）、草地早熟禾（Poa pratensis）等為常見種或伴生種。土壤類型為暗栗鈣土（Zhang et al.，2008）。

1.2 樣地設置與樣品采集

于2010年6月設置模擬氮沉降試驗。氮輸入水平設置主要考慮當前中國大氣氮沉降量及其未來 50年變化趨勢，同時考慮了國際同類研究的模擬氮沉降試驗（莫江明等，2004；Clark et al.，2007）。設置對照（N0，0 kg?hm-2?a-1）、低氮（N30，30 kg?hm-2?a-1；N50，50 kg?hm-2?a-1）、高氮（N100，100 kg?hm-2?a-1；N150，150 kg?hm-2?a-1；N200，200 kg?hm-2?a-1）6 種處理。每個樣方面積為 8 m×8 m，樣方間設有2 m隔離帶，每種處理設置4次重復。每年于6月中旬、7月中旬施氮，每次施氮為全年的 50%，氮素為 NH4NO3。NH4NO3水溶后均勻噴施到小區(qū)內，對照小區(qū)同時噴灑等量水。

在模擬氮沉降試驗6年后，于2015年8月中旬按照S型取樣法選取10個點，用直徑為3 cm的土鉆取0～10、10～20 cm土層土壤，各自分別混勻。去除根系和土壤入侵物，將其分成兩份，一份保存于冰盒中帶回實驗室，置于-20 ℃低溫保存，用于土壤水分、速效養(yǎng)分、微生物生物量碳氮含量測定；另一份土樣于室內自然風干，用于土壤理化性質和酶活性測定。

1.3 測定方法

土壤含水量用稱量法測定。土壤pH采用玻璃電極法（土水質量比1∶2.5）測定。土壤總有機碳、全氮、全磷、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量采用常規(guī)分析法測定（鮑士旦，2005）。土壤微生物生物量碳、氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法測定（吳金水等，2006）。

土壤酶活性測定參考關松蔭的《土壤酶及其研究方法》（關松蔭，1986）。土壤脲酶活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法，以24 h后1 g風干土壤經尿素水釋出的NH4+-N的質量（μg）表示；土壤酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法，其活性以2 h后1 g土壤P2O5d的質量（mg）表示；土壤過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法，其活性以 1 g風干土消耗0.1 mol?L-1KMnO4的體積（mL）表示；土壤過氧化物酶和多酚氧化酶采用鄰苯三酚法，其活性以2 h后1 g土壤中紫色沒食子素的質量（mg）表示；土壤蔗糖酶采用3, 5-二硝基水楊酸比色法，其活性以24 h后1 g土壤葡萄糖的質量（mg）表示。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

運用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。不同土層和施氮水平的交互作用采用雙因素方差分析，不同氮處理間和土層之間差異顯著性比較采用單因素方差分析和最小顯著差數法進行（P=0.05），酶活性之間及其與化學性質之間的關系采用 Pearson相關分析。圖表中的數據均為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 氮沉降增加對土壤理化性質的影響

連續(xù) 6年模擬氮沉降處理下，土壤理化性質的變化見表1。根據對同一土層不同氮沉降水平的方差分析結果可知，高氮沉降（N100、N150、N200）處理0～10 cm、10～20 cm土壤含水量和微生物生物量碳含量均低于或顯著低于對照N0（P＜0.05），土壤有機碳、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和微生物生物量氮均高于或顯著高于對照N0?？傮w上，氮沉降并未引起土壤全氮含量的顯著性變化。高氮沉降（N100、N150、N200）處理下，土壤 pH 下降，出現酸化現象。

相同氮沉降水平不同土層土壤有機碳、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和微生物生物量氮含量表現為0～10 cm土層高于或顯著高于 10～20 cm 土層。高氮沉降（N100、N150、N200）處理0～10 cm土層的土壤全氮含量高于10～20 cm土層，但無顯著差異。高氮沉降（N100、N150、N200）處理0～10 cm土層的土壤pH值顯著低于10～20 cm土層。除N100處理0～10 cm土層微生物生物量碳含量顯著低于10～20cm土層外，其余氮處理0～10 cm土層土壤微生物生物量碳含量均顯著高于10～20 cm土層。

表1 不同氮沉降水平下土壤理化性質的變化Table 1 Soil physico-chemical properties in different nitrogen deposition treatments

不同土層和氮水平的交互作用對土壤理化性質變化雙因素方差分析見表 2。土層深度在影響含水量、pH值、有機碳、銨態(tài)氮、微生物生物量碳和微生物生物量氮方面具有主效應，氮沉降水平在影響硝態(tài)氮方面具有主效應，除全氮以外，土層和氮沉降處理水平對其他理化指標表現出明顯的交互作用。

表2 土壤理化性質、酶活性受土層和氮沉降處理水平變化影響的雙因素方差分析（F值）Table 2 Tow-way ANOVA of soil physico-chemical properties and enzymes activities under soil layer and nitrogen deposition

2.2 氮沉降增加對土壤酶活性的影響

連續(xù)6年不同氮沉降水平下6種土壤酶活性的變化很大。0～10 cm土層，氮沉降增加降低了土壤脲酶活性，與對照N0相比，降幅分別為24.54%、13.79%、1.32%、22.66%和15.92%，其中N30抑制作用最顯著。10～20 cm土層，N100處理的脲酶活

圖1 氮沉降對脲酶活性的影響Fig. 1 Effects of nitrogen deposition on urease activity

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示土層之間差異顯著；n=3。下同

Different small letters indicate significant difference among different treatments (P＜0.05), different capital letters indicate significant differences between different soil layers (P＜0.05). The same below性高于對照N0，但無顯著性差異（圖1）。0～10 cm土層，N100的酸性磷酸酶高于對照N0，但無顯著差異；其他氮處理的酸性磷酸酶活性均低于或顯著低于對照N0；10～20 cm土層高氮處理（N100、N200）酸性磷酸酶高于對照N0，但無顯著差異（圖2）。0～10 cm土層，5個氮沉降處理的過氧化氫酶活性均顯著低于對照N0，降幅分別為13.13%、10.34%、19.79%、46.41%和 10.34%；10～20 cm 土層，N30和N50處理的過氧化酶活性與對照無顯著差異，高氮（N100、N150和N200）處理顯著低于對照，降幅分別為11.54%、31.73%和10.10%（圖3）。5個氮沉降處理的過氧化物酶在0～10 cm、10～20 cm土層均低于或顯著低于各自對照 N0，降幅分別為147.62%、40.54%、52.94%、100.00%和271.43%，58.18%、72.73%、1.82%、12.73%和30.91%（圖4）。N100處理的多酚氧化酶活性在0～10 cm、10～20 cm土層均顯著高于對照N0，而N150、N200處理在兩個土層的多酚氧化酶活性則顯著低于對照 N0（圖5）。5個氮沉降處理的蔗糖酶活性在0～10 cm土層、10～20 cm土層均低于或顯著低于各自對照N0，降幅分別為5.96%、2.88%、3.46%、5.00%和7.31%，5.78%、8.57%、37.26%、45.82%和44.33%（圖6）。

圖2 氮沉降對酸性磷酸酶活性的影響Fig. 2 Effects of nitrogen deposition on acid phosphtase activity

圖3 氮沉降對過氧化氫酶活性的影響Fig. 3 Effects of nitrogen deposition on catalase activity

圖4 氮沉降對過氧化物酶活性的影響Fig. 4 Effects of nitrogen deposition on peroxidase activity

圖5 氮沉降對多酚氧化酶活性的影響Fig. 5 Effects of nitrogen deposition on polyphenol oxidase activity

圖6 氮沉降對蔗糖酶活性的影響Fig. 6 Effects of nitrogen deposition on invertase activity

總體上，氮沉降降低了0～10 cm土層脲酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和蔗糖酶活性，降低了10～20 cm土層過氧化物酶和蔗糖酶活性。同一氮處理水平，不同深度土層的脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶和蔗糖酶活性表現為 0～10 cm＞10～20 cm。對照N0和低氮處理（N30、N50）在10～20 cm土層過氧化氫酶活性高于0～10cm土層，高氮（N100、N150 和 N200）處理低于 0～10 cm。

不同土層和氮水平的交互作用對土壤酶活性變化的雙因素方差分析表明（表2），土層深度在影響脲酶、酸性磷酸酶和多酚氧化酶活性方面具有主效應，氮沉降水平在影響過氧化氫酶、過氧化物酶和蔗糖酶活性方面具有主效應，除過氧化氫酶以外，土層和氮沉降處理水平對其他5種酶活性變化表現出明顯的交互作用。

2.3 土壤酶活性之間及其與土壤理化性質之間的相關性分析

不同氮沉降水平下，土壤酶活性之間的相關性分析見表3。在0～10 cm土層，脲酶與多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和酸性磷酸酶呈顯著正相關，酸性磷酸酶與多酚氧化酶和過氧化氫酶呈極顯著正相關，過氧化物酶與蔗糖酶和多酚氧化酶呈顯著正相關。10～20 cm土層，脲酶與多酚氧化酶極顯著正相關；酸性磷酸酶與過氧化物酶呈顯著正相關，過氧化氫酶與蔗糖酶呈極顯著正相關，過氧化物酶與多酚氧化酶呈極顯著正相關。說明土壤酶活性對氮沉降增加的響應存在共性關系。同時，兩個土層土壤酶活性之間的相關性分析結果不同，說明土層深度影響了酶活性之間的相關程度。

不同氮沉降水平下，土壤酶活性與環(huán)境因子的相關性分析見表4和表5。0～10 cm土層，土壤含水量與過氧化物酶和蔗糖酶呈顯著正相關，土壤pH值與酸性磷酸酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和蔗糖酶呈顯著正相關，土壤有機碳與多酚氧化酶和蔗糖酶呈顯著負相關，土壤硝態(tài)氮與酸性磷酸酶、過氧化物酶、多酚氧化酶和蔗糖酶呈顯著負相關，土壤微生物生物量碳與過氧化物酶和蔗糖酶呈極顯著正相關，微生物生物量氮與過氧化物酶、多酚氧化酶和蔗糖酶呈顯著負相關，銨態(tài)氮與多酚氧化酶呈極顯著正相關。10～20 cm土層，土壤含水量與過氧化氫酶和蔗糖酶呈顯著正相關；土壤pH值與過氧化氫酶和蔗糖酶呈極顯著正相關，與多酚氧化酶呈顯著負相關；土壤全氮與脲酶、過氧化氫酶和蔗糖酶呈顯著正相關；微生物生物量碳與酸性磷酸酶和過氧化物酶呈極顯著正相關；微生物生物量氮與過氧化物酶呈顯著正相關，與過氧化氫酶和蔗糖酶呈顯著負相關。

表3 土壤酶活性的相關性分析結果Table 3 Results of correlation analysis between soil enzyme activities

表4 0～10 cm土層土壤酶活性與土壤理化性質的相關性分析結果Tabel 4 Results of correlation analysis between soil enzyme activities and soil physico-chemical properties in the 0～10 cm soil layer

表5 10～20 cm土層土壤酶活性與土壤理化性質的相關性分析結果Tabel 5 Results of correlation analysis between soil enzyme activities and soil physico-chemical properties in the 10～20 cm soil layer

3 討論

3.1 氮沉降增加對土壤理化性質的影響

本研究中，連續(xù) 6年模擬氮沉降增加對土壤理化性質產生了一定的影響。土壤pH值隨氮沉降處理水平的增加呈降低的趨勢，高氮沉降（N100、N150、N200）處理 pH值顯著低于對照，這與前人的研究結果（蘇潔瓊等，2014）一致。連續(xù) 6年高濃度氮沉降（N100、N150、N200）造成土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量顯著升高，減緩了該地區(qū)土壤氮素的限制作用。但在本研究中，氮添加處理兩個土層全氮含量與對照相比均無顯著性升高，這可能與速效氮流失較快有關（Kim et al.，2011）。本研究中，隨著氮沉降水平的提高，土壤有機碳含量升高，這與劉星等（2015）等研究結果一致。這是因為氮沉降提高了草原植物的地上部生產力（于麗等，2015），提高凋落物和根系分泌物數量，促進了土壤有機碳的積累。此外，本研究高氮沉降造成土壤的酸化，對土壤微生物群落產生了一定的抑制作用（劉紅梅等，2017），進一步促進了土壤有機碳積累（蘇潔瓊等，2014；涂利華等，2009）。

3.2 氮沉降增加對土壤酶活性的影響

在連續(xù)6年模擬氮沉降增加處理下，貝加爾針茅草原土壤酶活性對氮沉降增加表現出了負反饋，而土壤酶活性的降低在一定程度上反映了土壤生態(tài)系統(tǒng)的退化（Kandeler et al.，1999）。本研究中，氮沉降抑制了0～10 cm土層脲酶活性，可能是模擬氮沉降增加了土壤中銨態(tài)氮含量，土壤有機氮的礦化速率降低，從而使土壤脲酶活性下降。這與孫亞男等（2016）研究結果一致。一些研究發(fā)現，氮沉降可提高土壤過氧化氫酶活性（王杰等，2014），而另一些研究則顯示無顯著影響（彭春菊等，2017）。氮沉降對土壤過氧化氫酶活性產生不同影響的原因可能是土壤類型、植被類型、氮添加時間長短不同導致（王杰等，2014；彭春菊等，2017）。本研究中，不同氮沉降水平對多酚氧化酶有顯著影響，0～10 cm土層，N150、N200表現為抑制作用，N30、N50和N100表現為促進作用；10～20 cm土層，N30、N50、N150、N200表現為抑制作用，N100表現為促進作用。Deforest et al.（2004）研究表明，多酚氧化酶活性隨氮的可利用性提高而降低。Zeglin et al.（2007）研究發(fā)現，氮沉降對多酚氧化酶的活性無顯著性影響。而張藝等（2017）研究發(fā)現，不同施氮水平對多酚氧化酶有顯著促進作用。這說明多酚氧化酶對氮沉降的負響應并不是一個普遍現象（張藝等，2017；Zeglin et al.，2007）。本研究中，高濃度氮沉降（N150、N200）降低了兩個土層的微生物生物量碳含量，抑制了多酚氧化酶活性，這與Deforest et al.（2004）研究結果一致。

土壤蔗糖酶直接參與土壤中含碳有機物的代謝和低分子量糖的釋放過程，是表征土壤碳素循環(huán)速度的重要指標（王啟蘭等，2007）。由于被抑制的脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性與土壤有機質的降解密切相關，說明氮沉降增加抑制了貝加爾針茅草原土壤有機質的降解，有利于土壤有機質的積累。Kim et al.（2011）研究表明，當本底土壤氮含量較高時，氮沉降的增加傾向于抑制酶活性，反之則有利于提高其活性。氮沉降增加影響土壤有機碳的積累和礦化，從而引起土壤中活性有機碳的含量變化。本研究中，0～10 cm土層微生物生物量碳與蔗糖酶呈極顯著正相關，印證了該觀點。土壤含水量是限制半干旱草原植物生長的重要因子，影響土壤酶活性的高低。由表4、表5可知，土壤含水量與土壤酶活性總體上呈正相關，這說明在半干旱的貝加爾針茅草原，適當進行水分添加，能夠促進土壤酶活性的提高。

各氮處理土壤脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶和蔗糖酶活性表現為0～10 cm土層高于10～20 cm土層，這與秦嘉海等（2014）研究結果相一致。該區(qū)域主要有貝加爾針茅（Stipa baicalensis）、羊草（Leymus chinensis）、羽茅（Achnatherum sibiricum）、早熟禾（Poa pratensis）、日陰菅（Carex pediformis）、寸草苔（Carex duriuscula）等草本植物，此類植物根系主要分布在0～10 cm土層，水熱條件和通氣狀況良好，微生物代謝活躍，呼吸強度加大，從而使此土層的土壤酶活性較高。隨著土層深度的加深，土壤根系生物量降低，土壤容重增加（范國艷等，2010），土壤微生物活動受到抑制（劉紅梅等，2017）。研究期間，土層深度、氮處理水平及其交互作用對貝加爾針茅草原土壤碳氮循環(huán)相關酶活性產生了顯著影響，主要表現為高氮沉降（N150、N200、N300）均降低或顯著降低了0～10 cm土層脲酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和蔗糖酶活性；氮沉降對10～20 cm土層6種酶活性的影響與0～10 cm土層不一致，表明土層深度影響土壤酶活性。

本研究中，土層深度、氮處理水平及其交互作用對6種酶活性的抑制或促進作用表現出一定的復雜性和不穩(wěn)定性，這可能與野外試驗條件的空間異質性、氮處理時間長短以及土壤環(huán)境因子不同等有關。本研究所得結論能初步反映氮沉降增加對貝加爾針茅草原土壤酶活性的影響，但仍然具有一定的局限性。今后的研究工作中，仍需開展土壤化學性質、酶活性的季節(jié)變化特征以及年度變化特征研究，為長期氮沉降增加對溫帶草甸草原的影響提供科學依據。

4 結論

（1）連續(xù)6年高濃度氮沉降導致貝加爾針茅草原0～10 cm土層、10～20 cm土層銨態(tài)氮和硝態(tài)氮發(fā)生累積，土壤pH值下降，對該地區(qū)土壤有一定的酸化作用，土壤有機碳含量升高，增加了土壤固碳潛力。

（2）連續(xù)6年高濃度氮沉降對貝加爾針茅草原土壤酶活性產生了顯著影響，降低了0～10 cm土層脲酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和蔗糖酶活性，降低了10～20 cm土層過氧化物酶和蔗糖酶活性。在未來氮沉降增加的背景下，中國北方溫帶草甸草原土壤水解酶和氧化酶活性將可能受到抑制，不利于土壤有機質的周轉。