高安麗 熊慶豐 姜 婧＊, 余 娟 樓麗廣 劉偉平＊,

(1昆明貴金屬研究所，稀貴金屬綜合利用新技術(shù)國家重點實驗室，昆明 650106)

(2中國科學院上海藥物研究所腫瘤藥理研究室，上海 201203)

目前化療仍是治療晚期惡性腫瘤的最基本手段之一，而以順鉑和奧沙利鉑為代表的鉑類藥在癌癥的化療中起著重要的作用，是治療肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和肝癌的一線化療藥物。然而，鉑類藥物的臨床應(yīng)用一直存在毒副作用大和出現(xiàn)耐藥性兩大問題[1]。因此，發(fā)展高效、低毒的新型鉑類抗癌藥物是無機藥物化學領(lǐng)域的一個重要研究方向，其中，鉑ビ前藥是研究的熱點。鉑ビ前藥屬于低頻八面體d6鉑ビ配合物，與鉑ギ配合物相比，動力學上具有很高的穩(wěn)定性，在血液中不進行水解作用或配體交換反應(yīng)，從而減小與生物大分子之間副反應(yīng)，降低毒副作用。鉑ビ)配合物一旦進入癌細胞，易被還原成鉑ギ原藥而活化，如圖1所示。同時，還可以通過選擇軸向配體Y來調(diào)控鉑ビ前藥的藥代動力學性質(zhì)(如溶解度、還原電位、分布)，獲得較理想的抗癌作用[2-5]。

圖1 鉑ビ前藥的還原活化反應(yīng)Fig.1 Reductive activation of platinumビprodrugs

最近30年來，先后有4種鉑ビ配合物進入臨床試驗，分別是四鉑(tetraplatin)、異丙鉑(iproplatin)、賽特鉑(satraplatin)和LA-12(圖2)，均未獲準上市，主要原因與水溶性低、藥代動力學性質(zhì)差，毒性大有關(guān)[6]。我國南京大學郭子建教授領(lǐng)銜的團隊、東南大學茍少華教授以及中山大學毛宗萬教授等在鉑類抗癌藥物方面也取得了重要的進展[7-11]。鉑類藥物也一直是本研究團隊的重點研究方向[12-14]。

磷酸是一個中等強度的無機酸，其pKa1=2.12，酸度與醋酸酐相當，具有一定的配位能力。磷酸還是細胞構(gòu)建核酸的主要成分之一，癌細胞旺盛的增殖對磷酸的需求明顯高于正常細胞，攝取磷酸的能力強，已有研究表明：藥物分子中連接磷酸基團，可能有助于藥物向癌細胞內(nèi)運轉(zhuǎn)，提高藥物對癌細胞的選擇性；同時，磷酸的引入可以提高藥物的親水性，是提高藥物溶解度的有效手段[15-17]?；谶@些考慮，我們設(shè)計出如圖3所示的鉑ビ前藥(其中，A2為氨/胺配體，X2為氯離子或二羧酸根)，并進行了一系列的化學合成試驗工作，就目前我們實驗室已有的合成路線和工藝，嘗試了很多次，只獲得結(jié)構(gòu)明確的2種配合物，分別標記為CPL-1501和CPL-1504。本文將報道這2種鉑ビ配合物的合成、結(jié)構(gòu)表征和抗癌活性。

圖2 進入臨床研究的鉑ビ前藥Fig.2 Chemical Structures of platinumビagents that have undergone clinical trials

圖3 以磷酸為軸向配體的鉑ビ前藥的設(shè)計理念Fig.3 Design concept of platinumビprodrugs with dihydrogen phosphate as axial ligand

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

85%(w/w)磷酸標準溶液和30%(w/w)過氧化氫均購自西隴化工股份有限公司；順鉑、奧沙利鉑購自昆明貴研藥業(yè)股份有限公司，實驗用水為二次去離子水，22.6℃電阻率不小于3.7 MΩ·cm。Vario ELⅢ型元素分析儀，BRUKER Tensor-27傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；BRUKER DRX-500核磁共振儀(13C NMR的化學位移以TMS內(nèi)標，31P NMR的化學位移以85%磷酸為內(nèi)標)；冷凍干燥器(DRC-1000/FDU-1100)；BAS100電化學工作站。

1.2 合 成

1.2.1 CPL-1500中間體的合成

中間體 cis，trans，cis-[Pt(NH3)2(OH)2Cl2]按照參考文獻[18]合成。即在60℃下，將過氧化氫(30%，252 mL)逐滴加入順鉑 (8.401 g，27.93 mmol)水溶液中(252 mL)。攪拌反應(yīng)4 h后，將得到的亮黃色溶液自然冷卻至室溫，靜置過夜，析出黃色晶體。過濾收集，并用冰水洗滌，真空干燥。將干燥后的黃色晶體在沸水中進一步重結(jié)晶提純后，得到亮黃色晶體4.77 g，產(chǎn)率為51%。按照熾灼殘渣檢查法(中國藥典2015年版)測定金屬鉑的含量為58.2%，與計算值(58.38%)一致。

1.2.2 CPL-1501配合物的合成

準確稱取 2.061 g(6.17mmol)的 cis，trans，cis-[Pt(NH3)2(OH)2Cl2]，加入85%磷酸標準溶液0.678 g(5.88 mmol，相當于化學計量的95%)，攪拌混合后，加入50 mL水，在60℃下攪拌反應(yīng)20 h，減壓濃縮至近干，再加入100 mL水溶解，冷卻至4℃，過濾除去未反應(yīng)黃色不溶物 cis，trans，cis-[Pt(NH3)2(OH)2Cl2]，濾液冷凍干燥，得到黃色晶狀粉末2.36 g，產(chǎn)率為93%。31P NMR(D2O，500 MHz)：δ 2.92(H2PO4-)；IR(KBr)：3443(s，νO-H)，3 265，3 176(s，νN-H)，1 632，1 564(m，δa(NH3))，1 321(m，νP=O)，1 040，1 009(m，νP-O)，558，537，521(w，νPt-N，νPt-O)。 元素分析按 N2H9PO5Cl2Pt計算(%)：N 6.76，H 2.17，Pt 47.1； 實測值 (%)：N 6.68，H 2.16，Pt 47.3，其中金屬鉑含量采用經(jīng)典的還原重量法測定。

1.2.3 CPL-1503中間體的合成

中 間 體 cis，trans，cis-[Pt((1R，2R)-DACH)(OH)2(C2O4)]按照參考文獻[19]合成。即將奧沙利鉑(6.001 g，15.11 mmol)加入水(600 mL)中，攪拌并升溫至溶液澄清，繼續(xù)攪拌30 min，然后自然冷卻至室溫，加入過氧化氫(30%，21.52 mL)。加入完畢后，室溫下攪拌反應(yīng)5 h，反應(yīng)過程中有青白色固體析出。過濾收集此固體，并用冰水洗滌，真空干燥。將干燥后的固體在沸水中重結(jié)晶提純，得到白色結(jié)晶狀固體5.75 g，產(chǎn)率為88.32%。按照熾灼殘渣檢查法測定金屬鉑的含量為45.2%，與計算值(45.24%)一致。

1.2.4 CPL-1504配合物的合成

準確稱取 2.406 g(5.58 mmol)的 cis，trans，cis-[Pt((1R，2R)-DACH)(OH)2(C2O4)]，加入 85%磷酸標準溶液0.637 g(5.52 mmol，相當于化學計量的 99%)，攪拌混合后，在60℃下加入30 mL水攪拌反應(yīng)20 h，減壓濃縮至近干，再加入50 mL攪拌溶解，冷卻至4℃，過濾除去少量的不溶物，濾液冷凍干燥，得到白色晶狀粉末2.75 g，產(chǎn)率為97%。13C NMR(DMSO，500 MHz)：δ 165(COO-)，61,30，23(cyclohexyl)。31P NMR(D2O，500 MHz)：δ 2.91(H2PO4-)。 IR(KBr，cm-1)：3 434(s，νO-H),3 201,3 092(m，νN-H),2 940,2 865(w，νC-H),1 721(vs，νas(COO-))，1 372(s，νa(COO-)),1 021，981(m，νP-O)，573，509(w，νPt-N，νPt-O)。 元素分析按 C8H17N2O9PPt計算(%)：C 18.8，H 3.32，N 5.48，Pt 38.2；實測值(%)：C 18.5，H 3.36，N 5.44，Pt 38.0， 其中金屬鉑含量采用經(jīng)典的還原重量法測定。

1.3 水溶性和穩(wěn)定性的測定

采用中國藥典中收錄的逐步加入溶劑的方法測定溶解度。水溶液穩(wěn)定性采用核磁共振譜的方法測定：取2 mg樣品，溶于0.5 mL D2O中，室溫放置，不同時間點采用Bruker DRX-500測定31P NMR，比較各個時間點測得的31P NMR與起始的31P NMR變化。

1.4 循環(huán)伏安測定

將鉑ビ前藥溶于去離子水中,制成1.0 mmol·L-1溶液，并使用0.05 mmol·L-1Na2SO4作支持電解質(zhì)。使用BAS100電化學分析器測定循環(huán)伏安圖，掃描速率為100 mV·s-1，恒定電位為0.9 V，起始電位為0.9 V，工作電極為玻璃碳電極，參比電極為Ag/AgCl，輔助電極為鉑絲。測試前通入5 min氮氣以排除溶液中氧氣。

1.5 體外抗癌活性

RPMI-1640、F-12培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司，胎牛血清購自SAFC公司，SPECTRA MAX 190型酶標儀購自Molecular Devices公司,SRB購自Sigma公司。人肝癌細胞株(SMMC-7721)、人非小細胞肺癌細胞株(A-549)、人乳腺癌細胞株(MCF-7)、人結(jié)腸癌細胞株(SW480)、人卵巢癌細胞株(SKOV3)和耐受順鉑的卵巢癌癌細胞株(SKOV3/DDP)均購自ATCC。

應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測藥物對腫瘤細胞(SMMC-7721，A-549，MCF-7，SW480，SKOV3，SKOV3/DDP)增殖生長的抑制作用。主要步驟如下：接種對數(shù)生長期懸浮細胞于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的藥物，每個濃度設(shè)復孔，同時設(shè)相應(yīng)濃度的溶媒對照。腫瘤細胞在37℃、5%(V/V)CO2條件下培養(yǎng)72 h后，加入MTT工作液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀測定OD值，計算抑制率，根據(jù)各濃度抑制率，根據(jù)非線性回歸方法計算半數(shù)抑制濃度 IC50。

細胞生長抑制率(Inhibitory rate)計算公式如下：

Inhibitory rate=(ODcontrol-ODdosing)/ODcontrol×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 以磷酸二氫根為軸向配體的Ptビ前藥的合成與表征

兩種鉑ビ前藥均是以原型藥物順鉑或奧沙利鉑為起始原料，通過雙氧水氧化制備出中間體cis，trans，cis-[Pt(A)2(OH)2(X)2]，再與磷酸在水溶液起中和反應(yīng)制備得到的。由于中間體cis，trans，cis-[Pt(A)2(OH)2(X)2]的水溶性非常低，我們通過控制磷酸的加入量少于理論計算量來獲得較純的目標產(chǎn)物CPL-1501和CPL-1504，合成路線見圖4。

目標產(chǎn)物通過NMR、IR和元素分析進行結(jié)構(gòu)表征。元素分析結(jié)果與理論值吻合良好。IR譜圖在1 032～1 047 cm-1范圍表現(xiàn)出中等強度的P=O伸縮振動峰；981～1 040 cm-1范圍內(nèi)的中等強度峰則歸屬于P-O伸縮振動；Pt-N和Pt-O的特征峰在509～573 cm-1范圍，為弱的吸收峰。2種化合物在3 092～3 265 cm-1處均表現(xiàn)出氨(胺基)配體N-H的伸縮振動，為寬的振動帶。2種目標配合物31P NMR譜圖中磷原子化學位移均在2.92左右，對應(yīng)于H2PO42-上磷原子的振動峰。而CPL-1504的13C NMR中，δ=165處的峰為羧基中碳原子的振動峰；23、30和61處3個峰分別為環(huán)己二胺配體的環(huán)己基上3種碳原子的峰。

常溫下，測得CPL-1501在水中的溶解度約為10 mg·mL-1，CPL-1504 在水中的溶解度約為 50 mg·mL-1。此外，CPL-1501配合物的D2O溶液在48h內(nèi)的31P NMR無明顯變化，說明其在水溶液中具有很好的穩(wěn)定性，能夠維持穩(wěn)定至少48 h，明顯高于順鉑(t1/2＜30 min)，滿足作為注射藥物使用的要求。測得各個時間點CPL-1501在D2O中31P的化學位移值如表1所示。

圖4 目標化合物的合成路線圖Fig.4 Synthesis routes of the target compounds

表1 各個時間點測得31P NMR的化學位移Table 1 Chemical shift of31P NMR tested of each time with respect to phosphoric acid

2.2 體外抗癌活性

2.2.1 CPL-1501的體外抗癌活性

以順鉑、卡鉑為陽性對照，采用MTT法測試了不同濃度的CPL-1501以及中間體CPL-1500對5種人癌細胞株生長的抑制濃度，這5種癌細胞株分別為人肝癌細胞株(SMMC-7721)、人結(jié)腸癌細胞株(SW480)、人非小細胞肺癌細胞株(A-549)、人乳腺癌細胞株(MCF-7)、人卵巢癌細胞株(SKOV3)，它們是對鉑類藥物比較敏感的瘤株，對應(yīng)的也是我們?nèi)祟惓Ｒ姸喟l(fā)的惡性腫瘤。從濃度-細胞成活率的曲線計算出藥物對癌細胞生長的半數(shù)抑制濃度IC50(表2)。可以看出，CPL-1501體外對癌細胞株生長均有明顯的抑制作用，且整體抗癌活性與順鉑相當、明顯高于卡鉑。而其中間體CPL-1500體外僅對人肝癌細胞和人結(jié)腸癌細胞生長有較高活性，對其他3株癌細胞沒有明顯的抑制活性。因此，在軸向引入一個磷酸作配體，可以加強鉑ビ前藥的抗癌活性，且可以取得與順鉑相媲美的效果。

為了進一步評價配合物CPL-1501的抗癌作用，我們還采用MTT法測試并比較了它對耐受順鉑的卵巢癌癌細胞株 (SKOV3/DDP)生長的抑制活性。 結(jié)果表明(表 3)，對于 SKOV3/DDP，CPL-1501抑制活性下降，耐藥指數(shù)與順鉑相等，提示CPL-1501與順鉑之間存在交叉耐藥，這與前人的相關(guān)耐藥機制產(chǎn)生的研究結(jié)論相符，即CPL-1501和順鉑與癌細胞的DNA作用生成了結(jié)構(gòu)完全一樣的加合物cis-(H3N)2Pt/DNA，抗癌性質(zhì)一致[20]。

表2 CPL-1500和CPL-1501的體外抗癌活性Table 2 In vitro anticancer activity of CPL-1500 and CPL-1501

表3 CPL-1501體外對耐藥細胞株的抗癌活性Table 3 In vitro anticancer activity of drug-resistant cell lines of CPL-1501

2.2.2 CPL-1504的抗癌活性

以順鉑、奧沙利鉑為陽性對照，采用同樣的MTT法測試了不同濃度的CPL-1504以及中間體CPL-1503對3種人癌細胞株的抑制作用，計算IC50。結(jié)果表明(表4)：2種陽性藥物對癌細胞的生長都表現(xiàn)出明顯的抑制活性，IC50都在～120 μmol·L-1范圍內(nèi)。但CPL-1504以及中間體CPL-1503對這3株癌細胞沒有明顯的抑制活性，活性明顯低于其原藥奧沙利鉑，這說明發(fā)展對應(yīng)于奧沙利鉑的鉑ビ前藥無意義。

表4 CPL-1503和CPL-1504的體外抗癌活性Table 4 In vitro anticancer activity of CPL-1503 and CPL-1504

2.3 循環(huán)伏安測定

圖5 配合物CPL-1501和CPL-1504的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms of CPL-1501 and CPL-1504

如圖5所示，2種鉑ビ前藥的氧化還原過程均是不可逆的雙電子還原過程，因此，還原電勢為正向波的峰值(Ep)。由循環(huán)伏安圖測得CPL-1501的2個Ep值分別為0.16 V和-0.52 V，CPL-1504的2個Ep值分別為-0.51和-0.76 V。正向波的Ep值反映了鉑ビ還原為鉑ギ的難易度：軸配位為氯配體時，最容易還原；而軸配體為羥基時，最難還原。文獻報道已進入臨床研究的2種鉑ビ前藥異丙鉑 (軸配體為羥基)和四鉑(軸配體為氯配體)的Ep值分別為-0.73和-0.09 V[21-23]。我們設(shè)計合成的目標化合物 CPL-1501的還原電勢(-0.52 V)介于兩者之間，可以推測，在癌細胞中容易還原激活，表現(xiàn)出明顯的抗癌活性。但是，CPL-1504的還原電勢(-0.76 V)偏高，比較難還原，所以CPL-1504體外無明顯抗癌活性。

3 結(jié) 論

本文合成了一個第一代鉑類抗癌藥順鉑的前藥CPL-1501，它具有水溶性較高、穩(wěn)定性好、抗癌活性與順鉑相當?shù)膬?yōu)點，值得進一步研究和評價。目前，CPL-1501的結(jié)構(gòu)已獲得國家發(fā)明專利授權(quán)，我們正在評價其體內(nèi)抗癌活性和初步毒性。

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