馬菁雯,趙 艷

(上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 201900)

宮頸癌是影響女性健康和生命安全最常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其病理過(guò)程涉及多基因改變和多發(fā)生步驟。拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡA(TOP2A)的表達(dá)在血管生成、骨髓造血、能量代謝和腫瘤的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中具有重要意義[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是刺激腫瘤血管生成最主要的細(xì)胞因子之一[2]，可促使宮頸鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)的快速生長(zhǎng)[3]。本研究探索了TOP2A和VEGF在CSCC中的表達(dá)情況和臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集2015年2月—2016年6月我院婦產(chǎn)科64例CSCC組織標(biāo)本，并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。患者年齡38～70(51.3±9.2)歲，國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)盟FIGO(2009)分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者分別為30例、24例和10例。收集22例同時(shí)間段在我院婦產(chǎn)門(mén)診行宮頸活檢者正常宮頸組織標(biāo)本，且經(jīng)病理證實(shí)，受檢者年齡32～66(48.2±8.7)歲。所有患者未行術(shù)前化療和放療，無(wú)其他腫瘤病史。患者均簽署知情同意書(shū)。該研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 分別采用實(shí)時(shí)定量PCR法和免疫組化方法檢測(cè)各標(biāo)本中TOP2A、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)情況并進(jìn)行分析。

1.2.1實(shí)時(shí)定量PCR 采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取組織RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)合成cDNA，ABI Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行RT-PCR。以β-actin分別作為T(mén)OP2A和VEGF PCR標(biāo)準(zhǔn)參照。TOP2A、VEGF、β-actin的反轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物購(gòu)自廣州Thermo Fisher公司。TOP2A和VEGF相對(duì)表達(dá)量均采用2(-ΔΔCq)方法檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。正反向引物序列如下：TOP2A，5’-CATGCGCTAGACTCCGAGAACA-3’和5’-GCTTTGCGAGCATCCGGTA-3’；VEGF，5’-GAGCCTTGCCTTGCTGCTCTA-3’和5’-CACCAGGGTCTCGATTGGATG-3’；β-actin，5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’和5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。

1.2.2免疫組化 4%多聚甲醛固定標(biāo)本后行石蠟包埋并切片，采用Histostain-Plus試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行免疫組化染色，2位獨(dú)立雙盲的病理醫(yī)生進(jìn)行顯微鏡下染色結(jié)果評(píng)估。染色陽(yáng)性的棕黃色顆粒主要定位于胞漿內(nèi)，少部分分布于細(xì)胞核或細(xì)胞膜上。結(jié)果判讀：TOP2A和VEGF的陽(yáng)性信號(hào)均主要定位于胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒，少部分定位于細(xì)胞核或細(xì)胞膜上；TOP2A和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為“-”，5%～25%為“+”，>25%～50%為“”，>50%為“”，本研究中“-”和“+”屬于低表達(dá)，“”屬于中表達(dá)，“”屬于高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1不同宮頸組織中TOP2A和VEGF mRNA表達(dá)情況和相關(guān)性 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織中表達(dá)水平(P均<0.05)，見(jiàn)表1。Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TOP2A和VEGF mRNA表達(dá)具有顯著相關(guān)性(r=0.778,P<0.001)，見(jiàn)圖1。

表1 CSCC組織和正常宮頸組織中TOP2A和VEGF mRNA表達(dá)水平

圖1 CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA表達(dá)Pearson相關(guān)性分析

2.2CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA的表達(dá)和臨床參數(shù)的相關(guān)性 CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA的表達(dá)與患者年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)，與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3不同宮頸組織中TOP2A和VEGF蛋白表達(dá)情況及其相關(guān)性 免疫組化結(jié)果顯示，染色陽(yáng)性的棕黃色顆粒主要定位于胞漿內(nèi)，少部分分布于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，見(jiàn)圖2～11。CSCC組織中TOP2A和VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常宮頸組織中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA表達(dá)與臨床參數(shù)關(guān)系

注：①與Ⅰ期比較，P<0.05；②與陽(yáng)性比較，P<0.05。

圖2 TOP2A蛋白在正常宮頸組織中表達(dá)情況(×200)

圖3 TOP2A蛋白在CSCC組織中低表達(dá)(×200)

圖4 TOP2A蛋白在CSCC組織中中表達(dá)(×200)

圖5 TOP2A蛋白在CSCC組織中高表達(dá)(×200)

圖6 TOP2A陰性對(duì)照(×200)

圖7 VEGF蛋白在正常宮頸組織中表達(dá)情況(×200)

圖8 VEGF蛋白在CSCC組織中低表達(dá)(×200)

圖9 VEGF蛋白在CSCC組織中中表達(dá)(×200)

圖10 VEGF蛋白在CSCC組織中高表達(dá)(×200)

圖11 VEGF陰性對(duì)照(×200)

項(xiàng)目n免疫組化結(jié)果/例-+ 陽(yáng)性/例(%)TOP2ACSCC組織正常宮頸組織642241822414024060(93.8)①4(18.2)VEGFCSCC組織正常宮頸組織642261812416030058(90.6)①4(18.2)

注：①與正常宮頸組織相比，P<0.05。

2.4隨訪結(jié)果 本研究患者隨訪12個(gè)月。免疫組化結(jié)果中，TOP2A蛋白低表達(dá)(-和+)共26例，其中5例死亡，21例存活；TOP2A蛋白中表達(dá)()共14例，其中4例死亡，10例存活；TOP2A蛋白高表達(dá)()共24例，其中8例死亡，16例存活。而VEGF蛋白低表達(dá)(-和+)共18例，其中4例死亡，14例存活；VEGF蛋白中表達(dá)()共16例，其中4例死亡，12例存活；VEGF蛋白高表達(dá)()共30例，其中9例死亡，21例存活。基于上述研究結(jié)果繪制Kaplan-Meier生存曲線，表明TOP2A和VEGF蛋白高表達(dá)的患者生存率明顯低于陰性表達(dá)和低表達(dá)的患者，見(jiàn)圖12及圖13。

圖12 TOP2A蛋白不同表達(dá)水平的生存率

2.5CSCC組織中TOP2A和VEGF蛋白表達(dá)相關(guān)性 TOP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)和VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見(jiàn)表4。

3 討 論

圖13 VEGF蛋白不同表達(dá)水平的生存率

TOP是低氧耐受過(guò)程中最重要的異源二聚體分子，由α和β亞基構(gòu)成。α亞基對(duì)氧濃度高度敏感，是TOP分子的功能基團(tuán)和活化基團(tuán)[4]，而β亞基不受氧濃度的調(diào)節(jié)，是TOP分子的機(jī)構(gòu)基團(tuán)。目前已知已分離鑒定出的α亞基包括1α、2α、3α，它們都可與β亞基結(jié)合組成二聚體，進(jìn)而分別組裝成TOP1A、TOP2A和TOP3A。在缺氧條件下，TOP2A蛋白表達(dá)受氧依賴性降解域(ODD)調(diào)控[5]。然而，在正常氧濃度條件下，TOP2A蛋白易受泛素-蛋白酶體作用而降解。因此，TOP2A在正常機(jī)體的組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)處于低水平狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧濃度下降時(shí)，TOP2A的降解過(guò)程受到抑制，胞漿內(nèi)TOP2A表達(dá)增多[6]，并相繼轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，通過(guò)與TOP2A受體結(jié)合，啟動(dòng)靶基因特異序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)[7]，發(fā)揮其多種生物學(xué)功能。在缺氧條件下，TOP家族可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)[8]，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、代謝、轉(zhuǎn)移和血管生成[9-10]。因此，TOP2A可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著促進(jìn)作用。

已有研究表明，在正常組織和器官中，TOP2A蛋白呈低表達(dá)狀態(tài)，但是在腫瘤細(xì)胞如子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌中TOP2A蛋白表達(dá)明顯升高[11]。本研究結(jié)果顯示，在CSCC組織中，TOP2A mRNA表達(dá)水平和TOP2A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常宮頸組織。這可能跟宮頸鱗狀細(xì)胞癌惡性增殖的病理生理過(guò)程介導(dǎo)的缺氧機(jī)制有關(guān)[12-13]。有研究指出，TOP家族通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因和參與細(xì)胞能量代謝介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞缺氧耐受，從而促進(jìn)靶基因蛋白如survivin表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[14]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的CSCC組織中TOP2A mRNA表達(dá)水平明顯高于陰性患者。

VEGF是腫瘤細(xì)胞刺激血管生成的主要細(xì)胞因子之一，在細(xì)胞缺氧時(shí)其表達(dá)水平明顯增加。因此，缺氧條件下血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子依賴性血管生成是腫瘤組織生成新生血管的關(guān)鍵步驟[15]。許多惡性腫瘤細(xì)胞都能具有自分泌VEGF的能力，合成的VEGF能夠誘導(dǎo)血管生成，導(dǎo)致相應(yīng)的結(jié)構(gòu)和功能異常，從而加速腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，VEGF可增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞分裂，增加微血管的通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移和抑制細(xì)胞凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌患者血中VEGF水平顯著增加，VEGF可明顯促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的血管生成[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CSCC組織中，VEGF mRNA的表達(dá)水平和VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于正常宮頸組織，同其他研究結(jié)果一致。

既往研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的TOP2A可增加腫瘤細(xì)胞VEGF的合成[18]。本研究結(jié)果顯示，在CSCC組織中TOP2A和VEGF mRNA的表達(dá)水平均明顯高于正常宮頸組織，并且TOP2A的表達(dá)與VEGF的表達(dá)有顯著正相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，在CSCC組織中TOP2A呈高表達(dá)狀態(tài)，并且與放療敏感性密切相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，在CSCC組織中，TOP2A和VEGF mRNA表達(dá)水平與患者年齡無(wú)明顯相關(guān)性，而與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。部分研究發(fā)現(xiàn)TOP2A可能在部分腫瘤具有特異性，例如TOP2A在小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者體內(nèi)呈低表達(dá)，且不影響腫瘤細(xì)胞的存活時(shí)間[20]；而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者高表達(dá)TOP2A，生存時(shí)間顯著縮短，這表明TOP2A可能是一個(gè)獨(dú)立的影響患者預(yù)后的指標(biāo)[21]。TOP2A可結(jié)合VEGF基因啟動(dòng)子[18]，增加VEGF mRNA的表達(dá)。高表達(dá)的VEGF促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖和遷移，促進(jìn)血管新生，從而在一定程度上改善腫瘤組織的缺氧狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TOP2A和VEGF mRNA的高表達(dá)可能預(yù)示著宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)繪制Kaplan-Meier生存曲線，筆者發(fā)現(xiàn)TOP2A和VEGF蛋白高表達(dá)的患者總體生存率明顯差于陰性表達(dá)和低表達(dá)的患者，推測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床FIGO分期可能與生存率有一定相關(guān)性。

綜上，高表達(dá)的TOP2A可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，參與CSCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。而在正常的宮頸組織中，TOP2A和VEGF呈低表達(dá)狀態(tài)。這為CSCC的預(yù)防和治療提供了新的思路。