周 珍，王秀萍，張瑩雯

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病，因其并發(fā)癥多、危害大、發(fā)病率高一直備受關(guān)注[1]。糖尿病病理機制復(fù)雜，與代謝異常、高糖-蛋白激酶C途徑、氧化應(yīng)激等有關(guān)[2]。而胰島素抵抗是糖尿病典型的病理生理基礎(chǔ)[3]，是指由于各種原因?qū)е碌陌衅鞴賹σ葝u素的生理作用和敏感性降低，致使血液中的胰島素發(fā)揮不了正常的降糖功能，人體肝臟、肌肉、脂肪等組織對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖的利用降低，從而導(dǎo)致血糖升高。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是蛋白酪氨酸磷酸酶中的一種，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，是目前研究胰島素抵抗的新靶點，在胰島素抵抗等多種信號通路中起著重要作用[4-5]。有研究表明，PTP1B在胰島素抵抗信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制PTP1B活性可以促發(fā)胰島素受體自磷酸化和胰島素受體底物1(IRS-1)酪氨酸磷酸化，從而增加胰島素敏感性來緩解胰島素抵抗[6-7]。當(dāng)歸補血湯是祖國醫(yī)學(xué)中補氣養(yǎng)血的傳統(tǒng)代表方，主治勞倦內(nèi)傷、虛陽外浮、氣弱血虛等病癥。現(xiàn)代實驗及臨床研究表明其具有免疫調(diào)節(jié)性、抗氧化、心血管保護(hù)、降糖、降脂等多種作用，能通過抑制多個靶器官相關(guān)蛋白因子的表達(dá),改善糖尿病及其并發(fā)癥的病損變化[8-10]。本研究從抑制胰島素抵抗、增加胰島素的敏感性、抑制PTP1B蛋白表達(dá)等角度出發(fā)，探討了當(dāng)歸補血湯治療糖尿病的機制，旨在為其臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗資料

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級純系正常SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量200～220 g，10周齡，購自武漢大學(xué)動物實驗中心/ABSL-Ⅲ實驗室(許可證號：ScxK2008-0004)，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2藥材 當(dāng)歸補血湯(黃芪∶當(dāng)歸=2∶1，武漢大學(xué)中南醫(yī)院中藥房提供)，將黃芪、當(dāng)歸用自來水浸泡30 min后，分煎2次混勻，在水浴中濃縮，冷卻后裝瓶放于4 ℃冰箱備用；吡格列酮片(卡司平，購于武漢大學(xué)中南醫(yī)院西藥房)。

1.1.3主要試劑與儀器 鏈脲菌素(STZ)，購于美國Sigma公司，溶于1%檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.3；大鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，產(chǎn)品貨號E-EL-R0023c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；血糖試紙，美國強生；穩(wěn)豪倍優(yōu)型強生血糖儀，美國強生公司；倒置熒光顯微鏡，日本尼康Nikon Eclipse Ti-SR；瑞典BROMMA公司出產(chǎn)的LKB-V型超薄切片機；免疫組化試劑盒，武漢拜意爾生物科技有限公司。

1.1.4飼料 普通飼料(12%脂肪，60%碳水化合物，28%蛋白質(zhì))由武漢大學(xué)動物實驗中心/ABSL-Ⅲ實驗室提供，高脂高糖飼料(41%脂肪，41%碳水化合物，18%蛋白質(zhì))由北京華阜康生物科技有限公司提供。

1.2飼養(yǎng)條件 實驗前所有大鼠均在室溫(22±2)℃、相對濕度(55±5)%、光照周期12/12 h的環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周。實驗期間保證所有大鼠飲水、標(biāo)準(zhǔn)飲食充足，不予胰島素治療。

1.3糖尿病造模、分組及干預(yù) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，從中隨機選取10只作為空白組、10只作為當(dāng)歸補血湯組，余30只進(jìn)行高脂高糖飼料飼養(yǎng)4周后，注射小劑量STZ(30 mg/kg)，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功[11]。將30只造模成功大鼠隨機分為糖尿病組、糖尿病+當(dāng)歸補血湯組、糖尿病+吡格列酮組，每組10只，均繼續(xù)給予高脂高糖飼料飼養(yǎng)。當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+當(dāng)歸補血湯組給予當(dāng)歸補血湯3.57 g/(kg·d)灌胃，糖尿病+吡格列酮組給予吡格列酮(片劑研磨成粉末，溶解于蒸餾水中)10 mg/(kg·d)灌胃，空白組和糖尿病組給予生理鹽水5 mL/kg灌胃，均1次/d，連續(xù)5周。

1.4觀察項目

1.4.1大鼠一般情況 觀察各組大鼠飲水量、進(jìn)食量、尿量、精神、毛色、有無感染等，測量實驗開始前、灌胃前及灌胃5周后各組大鼠體質(zhì)量。

1.4.2血糖、血清胰島素水平 各組大鼠分別于灌胃前及灌胃5周后眼內(nèi)眥靜脈取血，采用美國強生血糖儀及配套試紙測定空腹血糖(FPG)，ELISA法測定空腹胰島素(FINS)水平。

1.4.3肝臟和骨骼肌中PTP1B蛋白表達(dá)情況 灌胃5周后，無菌條件下取各組大鼠肝臟和骨骼肌，切成0.2 cm厚條形，用4%多聚甲醛固定，依次將切片放入二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水洗，浸蠟后包埋，切片，脫蠟，修復(fù)抗原，加抗體，DAB顯色，蘇木素染色，脫水透明，樹膠封片。用光學(xué)顯微鏡觀察免疫組化切片(棕黃色深染區(qū)為陽性表達(dá)區(qū))，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分析切片的積分光密度(IOD值)：每組內(nèi)每張切片分別隨機挑選3個200倍視野進(jìn)行拍照，對每張照片應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析得出每張照片陽性的IOD值。IOD值越大，表示陽性表達(dá)越強。以每組照片的平均IOD值代表該組的IOD值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況與體質(zhì)量變化 糖尿病組大鼠較空白組和當(dāng)歸補血湯組活動減少，毛發(fā)粗糙，色澤暗淡,這一情況在糖尿病+當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+吡格列酮組得到明顯改善，且實驗期間糖尿病組相比其他各組進(jìn)水量、攝食量、尿量增加。實驗開始時各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃前，各組大鼠體質(zhì)量均明顯高于實驗開始時(P均<0.05)，且各造模組大鼠體質(zhì)量均明顯高于空白組和當(dāng)歸補血湯組(P均<0.05)，但各造模組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃5周后，空白組和當(dāng)歸補血湯組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，且明顯高于實驗開始時及灌胃前(P均<0.05)，但2組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各造模組大鼠體質(zhì)量均較灌胃前明顯下降(P均<0.05)，且均明顯低于空白組和當(dāng)歸補血湯組(P均<0.05)，但糖尿病+當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+吡格列酮組大鼠體質(zhì)量均明顯高于糖尿病組(P均<0.05)，而糖尿病+當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+吡格列酮組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

注：①與空白組和當(dāng)歸補血湯組比較，P<0.05；②與實驗開始時比較，P<0.05；③與灌胃前比較，P<0.05；④與糖尿病組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠灌胃前后FPG和FINS水平比較空白組和當(dāng)歸補血湯組大鼠灌胃前后FPG和FINS水平無明顯變化(P均>0.05)。灌胃前，各造模組大鼠FPG和FINS水平均明顯高于空白組和當(dāng)歸補血湯組(P均<0.05)，各造模組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃5周后，糖尿病組大鼠FPG和FINS水平無明顯變化(P均>0.05)，糖尿病+當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+吡格列酮組FPG和FINS水平均明顯低于灌胃前及糖尿病組(P均<0.05)，而糖尿病+當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+吡格列酮組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠灌胃前后FPG和FINS水平比較

注：①與空白組和當(dāng)歸補血湯組比較，P<0.05；②與灌胃前比較，P<0.05；③與糖尿病組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟、骨骼肌中PTP1B蛋白表達(dá)情況

2.3.1免疫組化鏡下表現(xiàn) 肝臟組織中，空白組和當(dāng)歸補血湯組陽性區(qū)域無明顯差異，各造模組染色強度顯著增強，陽性區(qū)域面積增大，且糖尿病組染色區(qū)顏色增強更為明顯，見圖1～5；骨骼肌組織中，各造模組細(xì)胞漿內(nèi)部可見明顯的深染顆粒呈棕黃色，糖尿病組更為明顯，而空白組僅見少量陽性染色區(qū)，見圖6～10。

圖1 空白組肝臟組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖2 當(dāng)歸補血湯組肝臟組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖3 糖尿病組肝臟組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖4 糖尿病+當(dāng)歸補血湯組肝臟組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖5 糖尿病+吡格列酮組肝臟組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖6 空白組骨骼肌組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖7 當(dāng)歸補血湯組骨骼肌組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖8 糖尿病組骨骼肌組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖9 糖尿病+當(dāng)歸補血湯組骨骼肌組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

圖10 糖尿病+吡格列酮組骨骼肌組織中PTP1B表達(dá)情況(×200)

2.3.2圖像分析PTP1B表達(dá)量 各造模組肝臟和骨骼肌中的PTP1B表達(dá)量均明顯高于空白組和當(dāng)歸補血湯組(P均<0.05)，糖尿病+當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+吡格列酮組明顯低于糖尿病組(P均<0.05)，而糖尿病+當(dāng)歸補血湯組和糖尿病+吡格列酮組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肝臟、骨骼肌中PTP1B蛋白表達(dá)情況

注：①與空白組和當(dāng)歸補血湯組比較，P<0.05；②與糖尿病組比較，P<0.05。

3 討 論

在機體的糖代謝過程中，胰島素通過直接作用于肝臟、肌肉來維持著血糖的穩(wěn)態(tài)[12-13]。在胰島素信號傳導(dǎo)過程中，分泌到體液中的胰島素與胰島素受體(IR)結(jié)合，IRb亞基通過自磷酸化使酪氨酸被磷酸化，從而激活I(lǐng)Rb亞基上蛋白酪氨酸激酶(PTK)，使胰島素受體底物(IRS)與IR結(jié)合，經(jīng)過進(jìn)一步激活糖代謝通路中的蛋白激酶B(PKB)和葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)，使體內(nèi)的糖脂代謝被啟動。在整個信號傳導(dǎo)過程中，酪氨酸的磷酸化是可逆的動態(tài)過程，其中PTK負(fù)責(zé)磷酸化過程，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP)負(fù)責(zé)去磷酸化過程。PTP1B是PTPs家族的一員，PTP1B通過作用于胰島素受體、胰島素受體底物等，使其去磷酸化而失活，最終胰島素信號傳導(dǎo)被終止，從而糖脂代謝被終止[14]。由此可見，在整個信號傳導(dǎo)過程中PTP1B起著重要的負(fù)調(diào)控作用，若PTP1B在脂肪細(xì)胞、骨骼肌和肝臟細(xì)胞中表達(dá)過度或活性增強，能使胰島素受體底物去磷酸化來終止胰島素信號的傳導(dǎo)，阻斷胰島素信號通路產(chǎn)生胰島素抵抗[15-16]。因此若能找到一種抑制PTP1B表達(dá)的藥物，就能提高胰島素受體及其底物的磷酸化水平，減弱PTP1B對胰島素受體底物的去磷酸化作用，就能起到類胰島素或胰島素增敏的效果。

糖尿病屬于祖國醫(yī)學(xué)中“消渴”范疇，針對其病機的當(dāng)歸補血湯由具有益氣活血作用的黃芪、當(dāng)歸組成?，F(xiàn)代藥理研究表明當(dāng)歸補血湯有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗纖改善凝血機制、糾正糖及脂蛋白代謝異常、抗氧化和清除自由基等作用[17]。《內(nèi)外傷辨惑論》中當(dāng)歸補血湯的黃芪與當(dāng)歸用量為5∶1，本方中沿用前期研究[9-10]的黃芪當(dāng)歸用量2∶1。其中黃芪能改善糖尿病患者的胰島素抵抗[18],其主要活性成分黃芪多糖具有抗氧化、清除氧自由基作用，可通過緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]、減少炎性因子白細(xì)胞介素-6的分泌[20]或通過抑制PTP1B的表達(dá)改善胰島素抵抗[21]。當(dāng)歸補血活血，可運載陽氣到達(dá)全身使陽生陰長，血運正常，當(dāng)歸中有效成分當(dāng)歸多糖亦有改善胰島素抵抗作用[22]。

本研究運用高脂飲食加STZ干預(yù)成功誘導(dǎo)出大鼠糖尿病動物模型，F(xiàn)PG、FINS升高，經(jīng)當(dāng)歸補血湯干預(yù)后，F(xiàn)PG、FINS明顯下降，大鼠的一般情況也得到改善，且其與吡格列酮降糖效果相當(dāng)。然對正常大鼠進(jìn)行當(dāng)歸補血湯灌胃后，其血糖并未下降。說明當(dāng)歸補血湯有明顯的降糖作用，主要是降低高血糖，對正常血糖并無影響。且通過免疫組化檢測到糖尿病組大鼠肝臟和骨骼肌中PTP1B蛋白表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步證實了糖尿病的發(fā)病機制與胰島素抵抗有一定的關(guān)系。而經(jīng)當(dāng)歸補血湯干預(yù)后，PTP1B蛋白表達(dá)明顯降低，且與吡格列酮組下降程度無明顯差異。說明當(dāng)歸補血湯降糖作用可能是通過降低肝臟和骨骼肌組織中PTP1B的蛋白表達(dá)，從而增強胰島素信號傳導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)糖代謝。然而當(dāng)歸補血湯降血糖作用是否僅僅從這一條途徑發(fā)揮作用及其增加胰島素敏感性的確切機制都有待進(jìn)一步研究證實。