王敬華， 虞培娟， 葛 平， 章強強， 肖艷群， 王慶忠， 徐 蓉， 陳 蓉，劉學(xué)杰， 蔣玲麗， 王雪亮， 王華梁

（1.上海市臨床檢驗中心，上海 200126；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科， 江蘇 蘇州 215004；3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040）

近年來，隨著社會人口老齡化進(jìn)程的加快，各種原因?qū)е碌拿庖吡Φ拖禄颊邤?shù)量不斷增加，深部真菌感染特別是深部絲狀真菌感染的發(fā)病率正逐年增加，在某些特定人群中其發(fā)病率甚至高于酵母[1-2]。臨床實踐表明，不同真菌對抗真菌藥物的敏感性存在較大差異[3]，甚至部分真菌對常用抗真菌藥物天然耐藥或不敏感，致使真菌引起的深部感染死亡率很高[4]。臨床實驗室現(xiàn)行真菌檢測方法相對滯后，急需一種能夠快速診斷病原性真菌感染的檢測方法[5-7]。目前，基因芯片技術(shù)已被成功應(yīng)用于細(xì)菌和病毒等病原微生物的核酸突變檢測及基因組多態(tài)性分析[8-11]。本研究嘗試將基因芯片技術(shù)用于病原性真菌的快速鑒定和耐藥性檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 （1）標(biāo)準(zhǔn)菌株：白念珠菌[CMCCC（F）Cla]、熱帶念珠菌[CMCCC（F）C2a]、克柔念珠菌[CMCCC（F）C6a]、近平滑念珠菌[CMCCC（F）C4a]、光滑念珠菌[CMCCC（F）Y10]、新型隱球菌[CMCCC（F）D2q]購于中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心；白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 90028）由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院項明潔教授惠贈。（2）臨床菌株：收集2013年8—2014年3月臨床實驗室分離的念珠菌和新型隱球菌共205株，其中上海長征醫(yī)院臨床微生物室120株、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院微生物科26株、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科36株、蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院微生物室23株，包括白念珠菌126株、熱帶念珠菌26株、光滑念珠菌10株、克柔念珠菌16株、近平滑念珠菌22株，新型隱球菌5株。

1.1.2 主要儀器和試劑 （1）主要儀器：本研究應(yīng)用上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院儀器共享服務(wù)平臺，主要儀器包括SmartArrayer 48 微陣列芯片點樣系統(tǒng)（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司）、GenePix 4000B激光共聚焦生物芯片掃描儀（美國Axon Instrument公司）。（2）主要試劑：真菌基因組DNA提取、純化試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，TaKaRa Taq（Code No.R001A）、dNTPmix和10×buffer、DL2000 DNA Marker（Code No.3427A）、6×loading buffer、TaKaRa pMD 18-T Vector Cloning Kit購于大連寶生物工程有限公司，醛基化玻璃芯片購于上海艮馳生物科技有限公司。實驗中所用引物和探針分別由生工生物工程（上海）股份有限公司和上海基康生物技術(shù)有限公司合成， 其中反向引物的5' 端以3-NHS-磺基花青酯為熒光標(biāo)記物，而探針合成后在其3' 端進(jìn)行氨基化修飾。

1.2 菌株準(zhǔn)備和藥物敏感性試驗

1.2.1 菌株準(zhǔn)備 試驗前所有菌株被接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，收集菌落備用。同時，選用上海博賽科技有限公司CROMagar念珠菌顯色板和法國生物梅里埃公司Vitek 2 Compact自動化微生物鑒定儀及其配套的鑒定卡對臨床分離菌株重新鑒定。

1.2.2 體外藥物敏感性試驗 采用微量稀釋法，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27-A3文件[12]進(jìn)行126株臨床分離致病性念珠菌的體外藥物敏感性試驗，以白念珠菌（ATCC 90028）為質(zhì)控菌株，用無菌蒸餾水將氟康唑原粉（美國輝瑞制藥有限公司，批號UK-49858）溶解成2 000 μg/mL儲存液，儲存液用RPMI-1640液體培養(yǎng)基做倍比稀釋，加入96孔微量板（100 μL/孔）中，調(diào)節(jié)藥物含量為0.25～128 μg/mL，35 ℃培養(yǎng)48 h，用肉眼觀察法閱讀結(jié)果。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）解釋標(biāo)準(zhǔn)：≤2 μg/mL為敏感，4 μg/mL為劑量依賴性敏感， ≥8 μg/mL為耐藥。只有當(dāng)生長對照菌株生長良好，且質(zhì)控菌株的MIC在CLSI M27-A3方案制定的范圍內(nèi)，才可判定氟康唑?qū)Π啄钪榫腗IC。

1.3 基因芯片制備

1.3.1 探針設(shè)計 在內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)2 （internal transcribed spacer-2，ITS-2）通用引物及ERG11基因特異性引物擴增區(qū)找出適合作為探針的所有序列，將候選序列遞交到GenBank進(jìn)行Blast比較，篩選出Tm值最接近、特異性最好的一段寡核苷酸進(jìn)行探針合成[10]。共設(shè)計3類探針，第1類為真菌共有探針，能夠與所有真菌雜交；第2類是致病真菌種特異性探針，其作用是將致病真菌鑒定到種；第3類為陽性對照探針。本研究所用探針序列見表1。本研究共設(shè)計18種真菌特異性探針，本文僅報道其中6種真菌的研究結(jié)果，其他探針將根據(jù)具體研究內(nèi)容另文報道。

1.3.2 點樣 配置終濃度為50 μmol/L的探針溶液，每個探針溶液取5 μL，分別溶于5 μL 6×檸檬酸鈉（saline sodium citrate，SSC）中，然后依次轉(zhuǎn)移到一塊嶄新的384孔板中，用Smart Arrayer 48微陣列芯片點樣系統(tǒng)點樣至醛基化載玻片上，點心間距為500 μm。點樣時保持濕度90%，溫度23 ℃。點樣后的芯片在使用前于室溫放置至少24 h。應(yīng)用自動點樣儀制備多張用于常見致病真菌檢測的基因芯片。每張芯片含有l(wèi)6個相同的陣列，每個陣列為9×9個探針點。各種探針在芯片上的對應(yīng)位置見表2。

表1 本研究所用的探針序列

表2 寡核苷酸探針在芯片上的對應(yīng)位置

1.3.3 化學(xué)封閉 封閉芯片上未與寡核苷酸結(jié)合的醛基[10]：用0.2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（25 ℃）洗滌5 min；純水（25 ℃）洗滌5 min；純水（95 ℃）洗滌2 min；迅速將玻片放入封閉液（1.3 g NaHB4溶于375 mL磷酸鹽緩沖液中，再加入125 mL無水乙醇）洗滌5 min；0.2%SDS（25 ℃） 洗滌1 min；純水（25 ℃）洗滌1 min。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增真菌ITS-2、ERG11基因

1.4.1 真菌基因組DNA模板制備 將試驗菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～24 h，收集菌落至滅菌去離子水。采用真菌基因組DNA提取、純化試劑盒提取真菌基因組DNA，按照操作說明書進(jìn)行操作。

1.4.2 引物合成 合成真菌rDNA ITS-2擴增通用引物，針對已被證實存在于白念珠菌ERG11基因中、可導(dǎo)致菌株對氟康唑耐藥的6種常見點突變（C368T、T394C、A427C、T613G、T769C、C1506A），分別設(shè)計能夠識別耐藥株所含突變點的特異性引物，要求每對引物僅可以擴增含有其對應(yīng)突變點的耐藥菌（突變株）相應(yīng)序列，而敏感株（野生型）因不含有該突變點而不會被擴增，并控制擴增序列的長度約為250 bp（表3），使每對引物擴增出相對獨立的一段序列，在該段序列的互補鏈上，篩選出Tm值最接近、特異性最好的一段寡核苷酸進(jìn)行探針合成（表1）。同時，設(shè)計不含針對突變點的普通引物作為實驗對照。針對6種突變序列，人工合成6條5' 端以Cy3標(biāo)記、約50 bp的互補的寡核苷酸鏈作為陽性對照。

1.4.3 PCR擴增真菌ITS-2、ERG11基因 PCR擴增真菌ITS-2、ERG11基因按照參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行操作。

1.4.4 ERG11基因的克隆、測序 設(shè)計2對引物，即ERG11-1和ERG11-2，分別擴增耐藥株ERG11基因728和815 bp片段[14]。按照試劑盒說明書，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建pMD18-T-ERG11質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌構(gòu)建克隆，每個菌株挑取10個克隆，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5 基因芯片雜交

1.5.1 芯片雜交 分別取擴增產(chǎn)物2和8 μL與雜交液（美國Unihyb Telechem公司）混合，加熱到98 ℃變性5 min，然后置于冰上，5 min后取出，將混合液轉(zhuǎn)移至芯片雜交區(qū)域。將芯片置于雜交盒中55 ℃保溫1 h。雜交后的芯片依次在洗液A（1×SSC，0.2%SDS）、洗液B（0.2×SSC）、洗液C（0.1×SSC）中各洗1 min。1.5.2 雜交結(jié)果的檢測與分析 芯片用GenePix 4000激光共聚焦生物芯片掃描儀以激發(fā)波長540 nm、發(fā)射波長570 nm掃描，產(chǎn)生精度為10 μm l6位Tiff圖像。應(yīng)用GenePixPro軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

表3 本研究所用的引物序列

2 結(jié)果

2.1 臨床分離菌株的鑒定及藥物敏感性試驗

采用CRO Magar念珠菌顯色板和Vitek 2 Compact自動化微生物鑒定儀重新鑒定205株臨床分離菌株，其中白念珠菌126株、熱帶念珠菌26株、光滑念珠菌10株、克柔念珠菌16株、近平滑念珠菌22株、新型隱球菌5株；采用微量稀釋法，184株念珠菌中檢出耐藥株17株，包括白念珠菌12株（含實驗室前期保存的耐藥菌株6株）、熱帶念珠菌2株、近平滑念珠菌2株、光滑念珠菌1株。本研究未檢測克柔念珠菌（天然耐藥）和新型隱球菌對氟康唑的耐藥性，白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率分別為5.0%（6/120）、7.7%（2/26）、9.1%（2/22）和10.0%（1/10）。

2.2 PCR擴增真菌ITS-2、ERG11基因

采用真菌rDNA ITS-2基因擴增通用引物，PCR擴增白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌及新型隱球菌ITS-2，見圖1。采用ERG11-1和ERG11-2 2對引物，成功擴增ERG11基因的2個片段（728和815 bp），見圖2。

圖1 PCR擴增真菌ITS-2

圖2 PCR擴增ERG11基因

2.3 不對稱熒光PCR擴增真菌ITS-2基因

以普通PCR為對照，采用不對稱熒光PCR，擴增真菌ITS-2基因[13]。限制性引物（P1）按照1∶30、1∶40、……1∶90稀釋，分別與熒光標(biāo)記引物（P2）配對，構(gòu)建不對稱熒光PCR，擴增ITS-2基因單鏈DNA。隨著限制性引物（P1）濃度逐漸降低，ITS-2基因雙鏈DNA的合成逐漸減少，而單鏈DNA合成逐漸增加。見圖3。

圖3 不對稱熒光PCR擴增真菌ITS-2基因

2.4 PCR擴增ERG11點突變

采用本研究設(shè)計的6對能夠識別ERG11耐藥點突變的特異性引物，分別擴增野生菌株、耐藥菌株，并以普通引物為對照。本研究從12株耐藥白念珠菌株中成功擴增出4個含有點突變的序列，且4對引物（C368T、T394C、T613G、T769C）僅擴增含有其對應(yīng)突變點的耐藥菌相應(yīng)序列，野生株未被擴增，用不針對相應(yīng)突變點的普通引物，可以成功擴增出敏感株（野生株）的相應(yīng)PCR片段。見圖4。

圖4 PCR擴增ERG11點突變

2.5 ERG11點突變測序結(jié)果

將PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，在12株白念珠菌耐藥菌株中共發(fā)現(xiàn)4個突變點，即C368T、T394C、T613G、T769C。見圖5。

圖5 ERG11點突變測序結(jié)果

2.6 5種念珠菌和新型隱球菌芯片雜交

將5種念珠菌和新型隱球菌ITS-2基因不對稱熒光PCR擴增產(chǎn)物與基因芯片上的特異性探針進(jìn)行雜交，本研究制備的基因芯片，能夠成功鑒定出臨床分離到的5種念珠菌和新型隱球菌。見圖6。

圖6 5種念珠菌和新型隱球菌芯片雜交結(jié)果

2.7 基因芯片技術(shù)檢測白念珠菌ERG11基因點突變

基因芯片技術(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)菌株白念珠菌（ATCC 90028）、臨床分離耐藥菌株（zs113、cz10、cz143、fey41、hs60、hs74、cz159）ERG11基因點突變，結(jié)果見圖7。其中，標(biāo)準(zhǔn)菌株白念珠菌（ATCC 90028）未檢出任何點突變，在編號為zs113、cz10、cz143、fey41、hs60、hs74、cz159的真菌臨床分離菌株依次檢出C368T、T769C、T613G、T394C、T394C/C368T、T394C/C368T、C368T/T613G點突變。

圖7 基因芯片技術(shù)檢測白念珠菌ERG11基因點突變

3 討論

本研究收集臨床分離的真菌共205株，其中念珠菌200株、新型隱球菌5株。經(jīng)CROMagar念珠菌顯色平板和Vitek 2 Compact自動化微生物鑒定儀重新鑒定，其中白念珠菌126株、熱帶念珠菌26株、近平滑念珠菌22株、光滑念珠菌10株、克柔念珠菌16株。采用微量稀釋法檢測念珠菌對氟康唑的藥物敏感性，除克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥外，白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率分別為5.0%（6/120）、7.7%（2/26）、9.1%（2/22）和10.0%（1/10）。其中，熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌耐藥株檢出率略高于文獻(xiàn)[15]，可能與本次藥物敏感性試驗菌株數(shù)較少有關(guān)。

采用常規(guī)PCR成功擴增出6種臨床分離真菌ITS-2；將限制性引物（正向引物P1）按照1∶80～1∶90稀釋后，與3-NHS-磺基花青酯標(biāo)記的反向引物P2組成不對稱熒光PCR，可以成功擴增出ITS-2單鏈DNA；采用2對引物，成功擴增ERG11基因728 和815 bp 2個片段， 經(jīng)構(gòu)建pMD18-T-ERG11質(zhì)粒測序，在12株耐氟康唑的白念珠菌中共發(fā)現(xiàn)4種突變點（C368T、T394C、T613G、T769C）。

采用序列特異的寡核苷酸（氨基化探針）點樣于醛化玻璃芯片上，制備寡核苷酸芯片，與不對稱熒光PCR擴增的205株臨床分離菌株ITS-2基因單鏈DNA雜交，5種臨床常見致病性念珠菌和新型隱球菌均能被準(zhǔn)確鑒定，說明該試驗方法具有很好的特異性。

本研究通過改變局部堿基（突變點局部1～2個堿基錯配），設(shè)計能夠識別ERG11基因特定點突變的特異性探針，可以特異性地擴增出攜帶該突變點的突變株（耐藥株）約250 bp的ERG11片段，而野生株（敏感株）ERG11基因則完全未被擴增，采用正常引物（堿基完全匹配引物）則可擴增出野生株ERG11基因的此段正常序列，提示該引物具有很好的識別相應(yīng)點突變的特異性，其不對稱熒光PCR產(chǎn)物能夠與點樣于芯片的互補寡核苷酸序列（探針）雜交，從而被GenePix4000激光共聚焦生物芯片掃描儀識別，呈現(xiàn)雜交陽性結(jié)果。

應(yīng)用GenePixPro軟件，對GenePix4000激光共聚焦生物芯片掃描儀保存并生成的Tiff格式的圖像文件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在采用基因芯片技術(shù)鑒定臨床分離菌株和檢測ERG11點突變時，二者的背景熒光強度與每個像素點的熒光強度信噪比存在較大差異，前者的信噪比＜10%，而后者的信噪比均值為21.5%，具體原因不詳?；蛐酒夹g(shù)用于臨床常見病原性真菌鑒定，方法比較成熟，鑒定結(jié)果可靠。通過與PCR結(jié)果的比較，基因芯片技術(shù)可以用于ERG11點突變檢測，結(jié)果可靠，但試驗條件尚有待于進(jìn)一步優(yōu)化，以降低其信噪比。