鐘巧玲， 孫 驥， 翁旭琦， 馮 萍， 謝丹蕓

（1. 重慶市巴南區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400054；2.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，浙江 寧波 315000；3. 美康生物參考實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315104）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種含硫氨基酸，存在于血液及組織中，是人體內(nèi)蛋氨酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，參與體內(nèi)能量代謝[1]。正常情況下，人體中的Hcy水平為5～15 μmol/L，是正常的代謝中間產(chǎn)物[2]。近年來，有臨床研究證實(shí)，Hcy水平與血脂水平變化、各種心腦血管疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸有重要關(guān)系[3-4]。高水平Hcy與老年癡呆、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，其可作為血清腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤診斷或療效判斷[5-7]。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確、高效地檢測血液中Hcy水平具有重要意義。

目前，用于Hcy檢測的方法較多，有酶循環(huán)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析法、高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）、全自動熒光偏振免疫法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS/MS）等，這些方法各自存在不同的優(yōu)勢和不足[8-12]。其中，GC-MS和同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（isotopedilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS）被檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）認(rèn)定為參考方法[13]，這2種方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，但設(shè)備昂貴且操作復(fù)雜、耗時(shí)較長。HPLC應(yīng)用廣泛，費(fèi)用較低。放射免疫分析法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但操作繁瑣，且同位素的放射污染對人體有害。酶循環(huán)法檢測快速，適用于全自動生化分析儀，無需樣本預(yù)處理。因此，本研究以ID-LC/MS/MS為比對方法，評價(jià)酶循環(huán)法測定血清Hcy水平的正確度，為臨床常規(guī)檢測血清Hcy的正確性提供依據(jù)；并通過與參考方法比對，調(diào)整常規(guī)檢測系統(tǒng)，保證常規(guī)檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果與參考方法一致，以提高常規(guī)臨床檢測的質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 樣本

美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，20份新鮮單人份血清樣本，5個(gè)水平的Hcy工作校準(zhǔn)品。

1.2 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)購自美國AB SCIEX公司，XS 205DU型電子分析天平購自瑞士METTLER TOLEDO公司，Eppendorf 移液器、5427R 高速冷凍離心機(jī)、Heidolph Multi Reax旋渦混合器均購自德國Eppendorf AG公司，Millipore超純水儀購自美國Millipore公司。Hcy-d4內(nèi)標(biāo)購自美國Iso Sciences公司，DL-二硫蘇糖醇和三氟乙酸購自美國Sigma公司，甲醇（色譜級）、甲酸（色譜級）、乙腈（色譜級）購自美國Thermo Fisher公司。7180全自動生化分析儀（日本日立公司）及配套試劑（酶循環(huán)法）、校準(zhǔn)品。實(shí)驗(yàn)用水為一級水。

1.3 ID-LC/MS/MS

1.3.1 樣本前處理 用重量法稱取樣本或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于離心管中，分別加入內(nèi)標(biāo)、乙腈溶液，旋渦混合離心后取上清液100 μL，用甲醇水溶液稀釋至1 mL，混勻后檢測。

1.3.2 測定條件 （1）液相色譜條件：流動相A為0.1%甲酸甲醇溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為3 μL，柱溫為30 ℃，梯度洗脫；（2）質(zhì)譜分析條件：電噴霧電離源，離子化電壓為5 500 V，氣簾氣為35 psi，碰撞氣強(qiáng)度為中等，霧化溫度為550 ℃，霧化氣為55 psi，輔助加熱氣為40 psi，多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描分析，峰面積定量。

1.3.3 樣本檢測 采用ID-LC/MS/MS檢測NIST SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、5個(gè)水平的Hcy工作校準(zhǔn)品和20份新鮮單人份血清。

1.4 酶循環(huán)法

采用7180全自動生化分析儀及配套試劑測定5個(gè)水平的Hcy工作校準(zhǔn)品和20份新鮮單人份血清。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2013軟件和Origin 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以ID-LC/MS/MS作為比對方法，評價(jià)Hcy常規(guī)檢測系統(tǒng)測量結(jié)果的正確度。采用改良Bland-Altman圖形分析法評價(jià)常規(guī)方法（酶循環(huán)法）與比對方法之間的偏移。

2 結(jié)果

2.1 ID-LC/MS/MS的正確度驗(yàn)證

NIST SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出的Hcy水平為（8.50 ± 0.20）μmol/L。采用ID-LC/MS/MS檢測NLST SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定結(jié)果與證書一致，相對偏移＜1.0%。見表1。

表1 ID-LC/MS/MS檢測NIST SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果

2.2 酶循環(huán)法與ID-LC/MS/MS的比對

采用ID-LC/MS/MS和酶循環(huán)法同時(shí)檢測20份新鮮單人份血清。以ID-LC/MS/MS測定結(jié)果為X軸，酶循環(huán)法測定結(jié)果為Y軸，進(jìn)行方法學(xué)比對。2種方法的線性擬合方程為Y=1.204 1X+0.364 6（r2=0.987 9）。見圖1。

采用改良Bland-Altman圖形分析法進(jìn)行分析，2種方法的測定結(jié)果不一致，酶循環(huán)法測定結(jié)果整體偏高，平均偏移為24.0%。見圖2。

圖1 酶循環(huán)法與ID-LC/MS/MS測定結(jié)果的比較

圖2 酶循環(huán)法與ID-LC/MS/MS的Bland-Altman偏移圖

2.3 酶循環(huán)法常規(guī)檢測系統(tǒng)的調(diào)整

采用ID-LC/MS/MS和酶循環(huán)法同時(shí)檢測5個(gè)水平的Hcy工作校準(zhǔn)品，并根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整酶循環(huán)法試劑盒的校準(zhǔn)品值。調(diào)整結(jié)果后的測定結(jié)果見表2。以ID-LC/MS/MS測定結(jié)果為X軸，以酶循環(huán)法測定結(jié)果為Y軸，進(jìn)行方法學(xué)比對。調(diào)整后的酶循環(huán)法與ID-LC/MS/MS的線性擬合方程為Y=0.988 6X+0.260 3（r2=0.999 7）。見圖3。

采用改良Bland-Altman圖形分析法進(jìn)行分析，經(jīng)校準(zhǔn)品值調(diào)整后，酶循環(huán)法的測定結(jié)果與ID-LC/MS/MS一致，平均偏移為-0.09%。見圖4。

表2 酶循環(huán)法調(diào)整后與ID-LC/MS/MS測定結(jié)果的比較

圖3 酶循環(huán)法調(diào)整后與ID-LC/MS/MS法結(jié)果比較

圖4 調(diào)整后的酶循環(huán)法與ID-LC/MS/MS的Bland-Altman偏移圖

3 討論

Hcy水平的變化是多種疾病診斷的依據(jù)。目前，血清Hcy水平多采用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。因此，為確保臨床檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，有必要對Hcy的常規(guī)檢測系統(tǒng)進(jìn)行正確度評價(jià)。

Hcy的檢測方法有很多。本研究對臨床上使用比較廣泛的酶循環(huán)法進(jìn)行了評價(jià)。首先對JCTLM推薦的參考方法——ID-LC/MS/MS進(jìn)行了正確度評價(jià)，結(jié)果顯示ID-LC/MS/MS測定NIST SRM 1950標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)證書標(biāo)示值的偏移＜1.0%，準(zhǔn)確性良好。因此，ID-LC/MS/MS可作為Hcy常規(guī)檢測系統(tǒng)正確度評價(jià)的比對方法。

采用酶循環(huán)法和ID-LC/MS/MS同時(shí)檢測20份血清樣本的Hcy水平。常規(guī)方法的正確度依據(jù)線性擬合方程斜率k=1.00±0.02且截距接近于0、設(shè)定偏移值并用改良Bland-Altman圖形分析法進(jìn)行判斷。酶循環(huán)法和ID-LC/MS/MS測定結(jié)果的線性擬合方程為Y=1.204 1X+0.364 6（r2=0.987 9），平均偏移達(dá)24.0%。由此說明常規(guī)方法和參考方法測定結(jié)果的相關(guān)性并不理想，2種方法存在較大的偏移，為保證臨床檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需對其檢測系統(tǒng)進(jìn)行校正。

采用ID-LC/MS/MS和酶循環(huán)法同時(shí)測定5個(gè)水平的工作校準(zhǔn)品，根據(jù)測定結(jié)果反復(fù)調(diào)整校準(zhǔn)品值，直至酶循環(huán)法的測定結(jié)果與ID-LC/MS/MS一致。調(diào)整后的酶循環(huán)法與ID-LC/MS/MS的線性擬合方程為Y=0.988 6X+0.260 3（r2=0.999 7），平均偏移為-0.09%。由此可見，酶循環(huán)法調(diào)整后的測定結(jié)果與ID-LC/MS/MS的測定結(jié)果達(dá)到了一致。

綜上所述，采用酶循環(huán)法測定血清Hcy水平的正確度難以保證。因此，需要利用參考方法對常規(guī)檢測系統(tǒng)進(jìn)行正確度評價(jià)，同時(shí)也可以利用參考方法校準(zhǔn)常規(guī)檢測系統(tǒng)，以有效保證臨床樣本測定結(jié)果的正確性，提升臨床檢測質(zhì)量。為保證臨床樣本的準(zhǔn)確測定，各廠家和臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立常規(guī)檢測項(xiàng)目的測量正確度評價(jià)方法，以保證常規(guī)檢測系統(tǒng)的正確性[14]。