王大剛，李凱，智海劍

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大豆抗大豆花葉病毒病基因研究進(jìn)展

王大剛1，李凱2，智海劍2

（1安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/安徽省農(nóng)作物品質(zhì)改良重點(diǎn)實驗室，合肥 230031；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所/國家大豆改良中心/ 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實驗室，南京 210095）

大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）病是嚴(yán)重危害世界大豆（(L.) Merr.）生產(chǎn)的主要病害之一。近十年來，國內(nèi)外關(guān)于大豆對SMV抗病基因的遺傳標(biāo)記定位、候選抗病基因的分析及大豆抗SMV的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等研究取得許多新進(jìn)展。大豆對SMV的抗性遺傳主要分為數(shù)量抗性和質(zhì)量抗性，其中數(shù)量抗性的遺傳主要由1對加性主基因+加性-顯性多基因共同控制；對不同SMV株系的質(zhì)量抗性遺傳分別由1對不同的顯性基因控制。標(biāo)記定位研究發(fā)現(xiàn)，大豆對SMV數(shù)量抗性位點(diǎn)主要分布在大豆的第6、10和13等染色體上。22個對SMV具有單顯性質(zhì)量抗性的基因位點(diǎn)已被標(biāo)記定位在大豆的第2、6、13和14染色體上，且定位的多數(shù)抗病基因位點(diǎn)兩側(cè)標(biāo)記間的物理距離都在1 Mb以內(nèi)。其中第13染色體上的基因位點(diǎn)數(shù)最多，有、、R、R和R等10個，定位在第2染色體上的基因位點(diǎn)有8個，如、R、R、R和R等，第6和14染色體上各有2個基因位點(diǎn)，分別為R、R和、R。參考大豆全基因組序列（http://www.phytozome.net/soybean），利用生物信息學(xué)方法、表達(dá)譜分析及克隆測序技術(shù)等進(jìn)一步縮小了大豆抗SMV候選基因的篩選范圍。目前，在大豆第2染色體上確定的抗SMV候選基因主要有8個：、、、、、、和，在第6染色體上的是，在第13和14染色體上的抗SMV候選基因分別有9個和6個：、、、、、、、和、、、、、。基于病毒誘導(dǎo)的基因沉默VIGS（virus induced gene silencing，VIGS）和轉(zhuǎn)基因操作等技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)抗SMV相關(guān)基因、、等參與大豆對SMV的抗性，屬于正調(diào)控因子；而和等則增加大豆對SMV的易感性，為負(fù)調(diào)控因子。在綜合SMV抗病基因的相關(guān)研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于和介導(dǎo)對SMV極端抗性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。介導(dǎo)的大豆對SMV極端抗性調(diào)控模型的建立為大豆抗SMV信號網(wǎng)絡(luò)的研究提供了新的方向。介導(dǎo)的大豆對SMV極端抗性的主要機(jī)制是通過ABA信號的傳導(dǎo)，從而使胞間連絲處的胼胝質(zhì)沉積以抑制病毒從最初侵染的細(xì)胞向健康細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本文系統(tǒng)綜述了SMV抗病基因方面的最新研究成果并對該領(lǐng)域未來的研究方向進(jìn)行了展望，以期為大豆抗SMV分子設(shè)計育種和抗病基因的機(jī)理研究提供參考。

大豆；大豆花葉病毒；抗病基因；標(biāo)記定位；功能研究

大豆（(L.) Merr.）是世界上食用植物油和植物蛋白的主要來源，生長過程中受多種病害侵染。其中，大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）病對大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)均可造成嚴(yán)重危害。由于SMV分布廣、危害重、化學(xué)藥劑難以防治，一直是大豆種植面臨的主要問題。選育和種植抗病品種是控制該病最經(jīng)濟(jì)、有效且對環(huán)境友好的防治方法。

篩選新的抗病種質(zhì)并發(fā)掘新的抗病基因是拓寬大豆抗病遺傳基礎(chǔ)、成功培育抗SMV品種的關(guān)鍵。國家和各省大豆新品種審定實行SMV抗性“一票否決”制[1]，對抗SMV育種起到了極大的推進(jìn)作用。隨著大豆抗SMV研究的深入，王大剛等[2]、李凱等[3]曾對國內(nèi)外學(xué)者在SMV抗源篩選、抗性遺傳方式和抗病基因分子標(biāo)記定位等方面的研究進(jìn)行了闡述。

本文主要聚焦SMV抗病基因的標(biāo)記定位、候選抗病基因的分析及抗SMV相關(guān)基因的功能鑒定和參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等研究，通過系統(tǒng)的梳理和總結(jié)，以期為大豆分子設(shè)計育種、抗SMV功能基因的利用和新基因的發(fā)掘提供參考。

1 大豆對SMV抗病基因的標(biāo)記定位

大豆對SMV的抗性主要存在數(shù)量抗性和質(zhì)量抗性兩類[4]。數(shù)量抗性遺傳主要由1對加性主基因+加性-顯性多基因共同控制[5]，利用中豆29×中豆32的重組自交系RIL（recombinant inbred lines，RIL）群體，郭丹丹等[6]研究還發(fā)現(xiàn)大豆對SMV株系SC3的數(shù)量抗性遺傳由2對等加性主基因控制。大豆對SMV質(zhì)量抗性遺傳，國內(nèi)外普遍認(rèn)為是由1對顯性抗病基因控制[7-11]。通過抗病品種與感病品種的正反交組合研究發(fā)現(xiàn)，大白麻對SMV株系SC4及齊黃22對SC8均是由單顯性核基因控制，且抗性不受細(xì)胞質(zhì)影響[12]。

迄今為止，已經(jīng)命名和定位的大豆抗SMV單顯性基因位點(diǎn)主要有“”（resistance of soybean mosaic virus，）系列和“R”（resistance of soybean mosaic virus in China，R）系列兩類。其中“”系列抗病基因位點(diǎn)主要有、、和等，由美國、加拿大和韓國等學(xué)者鑒定、命名和定位[13-28]（表1）；“R”系列抗病基因位點(diǎn)主要有R、R—R、R—R、R、R、R—R、R等，由中國和印度學(xué)者鑒定、命名和定位[27-47]（表1）。

表1 大豆花葉病毒（SMV）抗病基因位點(diǎn)的標(biāo)記定位

BARCSOYSSR_02_、BARCSOYSSR_06_、BARCSOYSSR_13_和BARCSOYSSR_14_簡寫為BS02、BS06、BS13和BS14。下同

BARCSOYSSR_02_, BARCSOYSSR_06_, BARCSOYSSR_13_ and BARCSOYSSR_14_ abbreviated as BS02, BS06, BS13 and BS14 respectively. the same as below

由表1可知，目前國內(nèi)外已標(biāo)記定位的SMV抗病基因位點(diǎn)有22個，主要分布在大豆第2、6、13和14染色體上，其中第13染色體上基因位點(diǎn)最多，有10個，定位在第2染色體上的基因位點(diǎn)有8個，而在第6和14染色體上均有2個SMV抗病基因位點(diǎn)。除少數(shù)幾個基因位點(diǎn)兩側(cè)分子標(biāo)記的物理距離較遠(yuǎn)外，多數(shù)抗病基因位點(diǎn)兩側(cè)分子標(biāo)記的物理距離均在1 Mb以內(nèi)（表1）。

SMV抗病基因位點(diǎn)最早由Yu等[15]利用SSR（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記SM176定位在大豆F連鎖群（第13染色體）上，遺傳距離為0.5 cM。利用RFLP（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、RAPD（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和SSR標(biāo)記，Gore等[18]構(gòu)建了包含和花生斑駁病毒抗病基因位點(diǎn)在內(nèi)的6.8 cM精細(xì)遺傳圖譜。Shi等[25]構(gòu)建J05與Essex雜交的F2群體，進(jìn)一步將位點(diǎn)定位在SSR標(biāo)記Sat_154和Satt510之間，遺傳距離分別為0.2和2.3 cM（表1）。參考大豆Willimas82全基因組序列（http://www.phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1），通過分析發(fā)現(xiàn)SMV抗病基因位點(diǎn)所在的物理區(qū)間起止位置為28 506 083—31 802 676 bp，物理距離3 296.6 kb（表1）。盡管是位點(diǎn)的一個等位基因[20]，但其在大豆第13染色體上的物理位置并不確定[48]。利用Suweon97和Willimas82的F2群體，Ma等[48]研究發(fā)現(xiàn)Suweon97攜帶的抗病基因定位在標(biāo)記BARCSOYSSR_13_1114和BARCSOYSSR_13_1115之間，與PI96983攜帶的位點(diǎn)屬于不同的區(qū)域。兩標(biāo)記間的物理距離為97.5 kb（http://www.phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1）。

位點(diǎn)被定位在大豆連鎖群B2（第14染色體）上標(biāo)記A519和M3Satt之間，遺傳距離分別為0.9和0.8 cM[19]，而基于標(biāo)記A519開發(fā)的3個SNP（single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記A519-460、A519-956和A519-1165與緊密連鎖[24]。Shi等[25]發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記Sat_424與大豆J05攜帶的緊密連鎖，遺傳距離為1.5 cM。利用新開發(fā)的標(biāo)記，Suh等[26]進(jìn)一步將定位在分子標(biāo)記S156l和BARCSOYSSR_14_1417之間，遺傳距離分別為0.3和0.5 cM，候選區(qū)域在第14染色體上的起止位置為46 852 283—47 059 763 bp（http://www.phytozome.net/ soybean，Wm82.a2.v1），物理距離207.5 kb（表1）。

Hayes等[49]利用BSA（bulked segregant analysis，BSA）法和F2群體將抗病基因定位在大豆D1b連鎖群（第2染色體）上，SSR標(biāo)記Satt558和Satt542與之間的遺傳距離分別為7.8和4.7 cM。利用比較作圖策略，Hwang等[50]進(jìn)一步將定位在EST（expressed sequence tag，EST）標(biāo)記AI856415-g和AW471852A之間，遺傳距離分別為2.8和2.4 cM?；诖蠖够蚪M鳥槍測序法，Saghai Maroof等[51]將鎖定在1.3 cM的精細(xì)作圖區(qū)域內(nèi)。2016年，Ilut等[27]對區(qū)域進(jìn)行了深度重測序，發(fā)現(xiàn)與兩側(cè)的標(biāo)記Rat2和S6ac的遺傳距離均為0.2 cM（表1），起止位置為12 044 285—12 163 994 bp（http://www. phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1），物理區(qū)間119.7 kb（表1）。

美國大豆品種York攜帶的抗病基因早先被命名為[52]，被推測是PI96983攜帶抗病基因位點(diǎn)的等位基因，2個品種對SMV株系G1–G7的抗性反應(yīng)存在差異[52]。Klepadlo等[28]利用PI96983（）×York（）構(gòu)建包含3 000個F2:3家系的群體檢測了2個抗病基因之間的等位性關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和是2個緊密連鎖的基因位點(diǎn)，遺傳距離為2.2 cM，物理距離約為440 kb，最后作者將York攜帶的抗病基因重新命名為[28]。

科豐1號是中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所從河北地方大豆品種系統(tǒng)選擇育成，對中國的18個SMV株系（SC1–SC13、SC16和SC18—SC21）和美國的7個株系（G1—G7）均具有抗性[53-55]。利用科豐1號×南農(nóng)1138-2組配的F2、RIL和剩余雜合系RHL（residual heterozygous lines，RHL）群體，Adhimoolam等[44]、Fu等[29]、Yan等[41]、Wang等[33]、Zhao等[43]、李春燕等[36]、郭東全等[56]和Li等[40]先后將科豐1號對SMV株系SC5、SC7、SC8、SC10、SC13、SC18攜帶的抗病基因R、R、R、R、R、R定位在大豆的第2染色體上（表1和圖1）。此外，陽小鳳等[38]將大豆品系Q0923對SC6株系具有的抗病基因R和中豆35攜帶對SC17的抗病基因R也均定位在第2染色體上（表1和圖1）。

根據(jù)大豆Willimas82的參考基因組序列（http:// www.phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1），結(jié)合上述標(biāo)記定位的結(jié)果分析可以發(fā)現(xiàn)，大豆第2染色體上的SMV抗病基因位點(diǎn)主要分布在11 188 722—13 104 514 bp（表1，圖1）。其中有6個SMV抗病基因位點(diǎn)的候選區(qū)段交叉重疊，集中分布在12 044 285—12 313 444 bp約269.2 kb的區(qū)間內(nèi)，推測這6個基因位點(diǎn)可能緊密連鎖或具有等位關(guān)系。進(jìn)一步對這一區(qū)間分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間內(nèi)有20個候選基因（—）（圖1，表2），但均不具有NBS-LRR（nucleotide binding site-leucine rich repeat，NBS-LRR）抗病基因保守結(jié)構(gòu)域。

齊黃1號是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從山東壽張地方品種系統(tǒng)選擇育成的另一個對SMV具有廣譜抗性的品種，對中國的18個SMV株系（SC1—SC8、SC11—SC14、SC16—SC18和SC20—SC22）和美國的7個株系（G1—G7）也均具有抗性[53-55]。利用F2、RIL和RHL群體，Zheng等[39]、白麗等[11]、Li等[30]、Ma等[31-32]、Li等[40]和Adhimoolam等[45]將齊黃1號及其衍生系齊黃22攜帶的抗SMV基因R、R、R、R、R和R均定位在大豆的第13染色體上（表1和圖2）。Yang等[37]將美國抗源PI96983攜帶對SMV株系SC3、SC6、SC17的抗病基因pm以及對SC7的抗病基因Rscps也均定位在第13染色體上相鄰的區(qū)域內(nèi)（表1和圖2）。

表2 抗病基因位點(diǎn)Rsv4、RSC5、RSC6、RSC7、RSC8和RSC17在大豆第2染色體上可能的候選基因a

a數(shù)據(jù)來源于大豆的全基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1，2018年3月12日），加粗字體表示第2染色體上可能性較大的SMV抗病候選基因。下同

aThe data from the soybean reference genome sequence (http://www.phytozome.net/soybean, Wm82.a2.v1, March 12, 2018)，the bold font indicates the putative candidate genes to SMV in soybean on chromosome 2. the same as below

虛線箭頭部分表示單個SMV抗病基因的物理區(qū)間；最下面的框內(nèi)是SMV抗病候選基因的個數(shù)及范圍。下同

圖2 大豆抗SMV基因在第13染色體上的遺傳、物理圖譜及抗病候選基因

基于大豆Willimas82的參考基因組序列（http:// www.phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1），結(jié)合標(biāo)記定位結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外定位于第13染色體上的SMV抗病基因位點(diǎn)的候選區(qū)段主要在27 656 895—31 951 960 bp成簇存在（圖2），物理距離為4.295 Mb，且這一區(qū)段內(nèi)富集著許多具NBS-LRR結(jié)構(gòu)域的候選基因（表3）。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，在4.295 Mb的物理區(qū)段內(nèi)，SMV抗病基因位點(diǎn)的候選區(qū)段均存在相互重疊的現(xiàn)象，相較于第2染色體上候選區(qū)段內(nèi)的基因數(shù)，第13染色體上候選區(qū)段內(nèi)的基因數(shù)量更多，推測該候選區(qū)段內(nèi)的多數(shù)基因連鎖較為緊密，難以發(fā)生交換。

表3 SMV抗病基因位點(diǎn)Rsv1、Rsv5、RSC3Q、RSC11、RSC12、RSC14Q、RSC18B、RSC20、Rsc-pm和Rsc-ps在大豆第13染色體上部分可能的候選基因

RN-9是繼科豐1號和齊黃1號后發(fā)現(xiàn)的又一個廣譜抗源，對15個SMV株系均表現(xiàn)極端抗性，特別是對能感染所有鑒別寄主的SC15株系表現(xiàn)抗病[35,47]。利用RN-9×7605的RIL群體，Yang等[35]將RN-9攜帶的對SMV株系SC15具有的抗病基因R定位在大豆第6染色體上，該基因與SSR標(biāo)記Sat_213和Satt286之間的遺傳距離分別為8.0和6.6 cM。2017年，Ren等[46]進(jìn)一步將R鎖定在標(biāo)記SSR_06_17和BS060835之間，遺傳距離分別為1.44和0.63 cM（表1），起止位置為15 635 537—15 730 967 bp（http://www. phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1），物理區(qū)間為95.2 kb（表1，圖3-a）。

此外，李凱等[47]將RN-9攜帶對SC18的抗性基因R定位在標(biāo)記Satt286和Satt277之間，遺傳距離分別為6.12和4.69 cM，物理區(qū)間為997.6 kb。參考大豆Willimas82的基因組序列（http://www.phytozome. net/soybean，Wm82.a2.v1），分析發(fā)現(xiàn)抗病基因R和R在第6染色體上的候選區(qū)段沒有重疊的區(qū)域（圖3-a）。其中，在95.4 kb的R候選基因區(qū)段內(nèi)存在5個候選基因（—），且均不具有NBS-LRR抗病基因保守結(jié)構(gòu)域（表4，圖3-a），在R候選基因區(qū)段內(nèi)，有73個候選基因存在（—）。

利用大白麻×南農(nóng)1138-2的F2作圖群體，Wang等[34]將大白麻攜帶的抗病基因R精細(xì)定位在大豆第14染色體上，緊密連鎖的2個基因組SSR標(biāo)記BARCSOYSSR_14_1413和BARCSOYSSR_14_1416與R的遺傳距離分別為0.17和0.27 cM（表1），物理距離63.4 kb（表1，圖3-b）。參考大豆Willimas82的基因組序列（http://www.phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1），結(jié)合R和定位結(jié)果分析可以發(fā)現(xiàn)，在大豆第14染色體46 852 283—47 135 871 bp共有17個可能的候選基因（表5），其中有5個候選基因具NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域。從圖3-b還可以發(fā)現(xiàn)，2個SMV抗病基因位點(diǎn)R和的候選基因位置具有重疊的物理區(qū)段，推測R與可能是等位或緊密連鎖的。

表5 抗病基因位點(diǎn)Rsv3和RSC4在大豆第14染色體上可能的候選基因

圖3 大豆抗SMV基因在第6和14染色體上的遺傳、物理圖譜及抗病候選基因

2 SMV抗病候選基因預(yù)測

隨著大豆對SMV抗病基因不斷地發(fā)現(xiàn)、標(biāo)記和精細(xì)定位，大豆對SMV候選抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析、qRT-PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）表達(dá)分析及克隆測序分析等也在不斷地拓展和深入，極大地縮小了候選基因的篩選范圍。

在第2染色體上，Saghai Maroof等[51]對的候選基因序列（http://www.phytozome.net/soybean，Wm82.a1.v1）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些基因均不具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域（圖1，表2），推測屬于一種新類型的抗病基因，其可能是通過干擾病毒感染和細(xì)胞間運(yùn)動，并延遲病毒在維管束間移動，從而達(dá)到抗病的目的。Ilut等[27]通過對SMV株系G1和G7具有不同抗性反應(yīng)的6個野生大豆和13個栽培大豆位點(diǎn)所在的120 kb的區(qū)域進(jìn)行深度測序分析發(fā)現(xiàn)，這一區(qū)域至少存在2個單倍型，其中最可能的一個單倍型包含4個候選基因：1個脅迫響應(yīng)基因、2個RD類受體蛋白酶基因（和）和1個銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（）（表2）。從基因結(jié)構(gòu)可以看出，這幾個候選基因均不具有經(jīng)典的NBS-LRR型抗病基因結(jié)構(gòu)，驗證了可能屬于一種新類型抗病基因的推測[27,50]。作者對該區(qū)域的單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)是最新才從野生大豆進(jìn)化到栽培大豆中的[27]。不過，Klepadlo等[28]通過對10個大豆品種的測序卻證實可能是的候選基因（表2）。

Adhimoolam等[44]將SNP標(biāo)記及抗性鑒定表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和qRT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，科豐1號攜帶對SC5最有可能的抗病候選基因是（）（表2）。

根據(jù)候選基因的結(jié)構(gòu)分析，Yan等[41]推測具NBS-LRR結(jié)構(gòu)域的基因，具有熱休克蛋白40（HSP40）結(jié)構(gòu)的基因（）和具有絲氨酸羧肽酶型（Serine carboxypeptidase-type）的基因可能是R的候選基因，不過基因和在最新的大豆參考基因組序列中已經(jīng)被重新進(jìn)行整合（http://www.phytozome.net/soybean，Wm82.a2.v1，2018年3月12日）。CHE等[57]通過GWAS（genome wide association study，GWAS）和qRT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、真核生物延伸因子和同源的3個大豆基因（、和）可能參與了大豆抗SC7株系的過程。

Wang等[33]運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對精細(xì)定位的R抗病候選基因分析發(fā)現(xiàn)，其中5個候選基因的表達(dá)量在抗感品種間的響應(yīng)模式或時間上有很大的差異，推測這些基因可能參與了大豆對SMV株系的抗性反應(yīng)。Zhao等[43]進(jìn)一步將R的候選基因確定為具M(jìn)ADS-box保守結(jié)構(gòu)域的基因和（表2）。

通過對SC15的抗病品種RN-9和感病品種7605的5個候選基因（—）DNA和cDNA進(jìn)行測序和qRT-PCR分析，Ren等[46]推測過氧化物膜蛋白基因（）是R最有可能的候選基因[46]。根據(jù)測序和表達(dá)分析，Li等[40]研究發(fā)現(xiàn)、和可能是科豐1號對SMV株系SC18的抗病候選基因（表4）。

通過分析大豆抗病基因位點(diǎn)定位區(qū)域的NBS-LRR基因簇，Hayes等[58]從抗SMV品種PI96983中克隆到一個在結(jié)構(gòu)上具有non-TIR（toll interleukin1 receptor，TIR）-NBS分子特征的抗病候選基因（），該基因全長3 390 bp，包含一個完整的編碼框，SHAO等[59]從抗病基因進(jìn)化的角度證實了（）是的一個候選基因。Ma等[48]對抗病基因的8個候選基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，和具有CC（coiled-coil，CC）-NBS-LRR抗病基因的保守結(jié)構(gòu)，推測這兩個基因可能是的最佳候選基因（表3）。

在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，Zheng等[39]通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，、（）、（）、（）和（）等5個基因可能是R的候選基因（表3）。Li等[42]進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR研究表明齊黃1號攜帶對SC3抗病基因R可能的候選基因為（）、（）、（）、（）等4個具NBS-LRR抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的基因（表3），其中有3個候選基因與Zheng等[39]的研究結(jié)果相一致。

Adhimoolam等[45]綜合候選基因的測序結(jié)果和qRT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，齊黃1號攜帶對SC20最有可能的抗病候選基因是和（表2）。

在大豆的第14染色體上，基于抗病基因R精細(xì)定位的結(jié)果，Wang等[34]參考Willimas82的參考基因組序列和qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)3個抗病候選基因（）、（）和（）在抗感品種間不同時間點(diǎn)的表達(dá)量具有差異，初步推測這些基因可能參與了大豆對SC4株系的抗性反應(yīng)（表5）。

對抗病基因所在的154 kb區(qū)段進(jìn)行分析，Suh等[26]發(fā)現(xiàn)這個區(qū)段是一個富集多個抗病基因的基因簇，其中有5個抗病候選基因（）、（）、（）、（）和（）編碼NB-LRR結(jié)構(gòu)的抗病蛋白（表5），作者認(rèn)為可能是NB-LRR家族中的一員[26]。值得注意的是，SMV抗病基因R和均在這個區(qū)段內(nèi)，說明R和屬于同一個抗病基因簇。Suh等[26]推測的基因和與Wang等[34]通過qRT-PCR獲得的抗病候選基因是一樣的，不過2個基因位點(diǎn)是不是同一個基因仍需進(jìn)一步的研究分析。

通過分析抗病品種L29接種SMV株系G7后1—3 h的表達(dá)量，Redekar等[60]發(fā)現(xiàn)，基因（）是5個候選基因中表達(dá)量最大的一個基因。比較測序研究表明，在抗病基因型（型）和感病基因型（3型）間有150個SNP和6個Indel差異，而且這種差異主要集中在LRR編碼區(qū)。因此，作者推測最有可能是的候選基因[60]（表5）。

3 SMV抗病相關(guān)基因篩選

大豆對SMV抗病基因的發(fā)掘除了利用精細(xì)定位圖位克隆外，還有通過同源克隆等方法獲得了一系列抗SMV相關(guān)基因的報道。

賀超英等[61]和Wang等[62]利用同源克隆的方法從科豐1號中獲得2個SMV抗性相關(guān)基因和，它們都具有NBS和LRR等抗病基因的結(jié)構(gòu)特征，RT-PCR分析表明二者均受SMV株系Sa接種和水楊酸處理的影響，推測和可能參與了大豆抗SMV的過程[62-63]。此外，Wang等[64]研究發(fā)現(xiàn)大豆同源異型-亮氨酸拉鏈蛋白基因具有HD-Zip結(jié)構(gòu)域，是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子。接種SMV株系N3后，該基因在感病品種中的表達(dá)量上調(diào)，而在抗病品種中則下調(diào)，初步證實可能作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與大豆對SMV的抗性（表6）。

表6 參與大豆抗大豆花葉病毒可能的相關(guān)基因

關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮合成酶基因與大豆對SC3的抗性顯著相關(guān)[65]。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)接種SC3后7 d，基因在抗病品種中的表達(dá)量顯著上調(diào)，而在感病品種中沒有變化，推測該基因可能參與了大豆抗SMV侵染的過程[65]。Zhang等[66]對大豆中一個耐脅迫基因研究發(fā)現(xiàn)，其能夠被SMV誘導(dǎo)表達(dá)，推測該基因可能是大豆對SMV抗性反應(yīng)的一個相關(guān)因子。是大豆中的一個PR10蛋白基因，RT-PCR分析表明，大豆接種SMV后該基因在葉片中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)并高效表達(dá)，推測其可能在病毒誘導(dǎo)下使大豆獲得系統(tǒng)抗性以抵抗外來病原菌的侵襲[67]。

通過轉(zhuǎn)錄組分析，He等[68]發(fā)現(xiàn)GAST（GA- stimulated transcript，GAST）基因亞家族成員在接種SMV后，在感病品種（感病型：）中的表達(dá)量下調(diào)，而在抗病品種（抗病型：）中沒變化。進(jìn)一步測序和聚類比較分析表明，GAST家族成員之一基因與土豆中的抗病基因同源，可能參與了大豆抗SMV的過程[68]。

4 大豆抗SMV相關(guān)基因的功能鑒定

在利用生物信息學(xué)、qRT-PCR及克隆測序等一系列技術(shù)對SMV抗病候選基因進(jìn)行預(yù)測和抗SMV相關(guān)基因進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)上，相關(guān)學(xué)者進(jìn)一步通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默VIGS（virus induced gene silencing，VIGS）、轉(zhuǎn)基因操作等技術(shù)對抗SMV相關(guān)基因的功能進(jìn)行了鑒定和研究。

與空載對照相比，Liu等[69-70]研究發(fā)現(xiàn)沉默大豆蛋白激酶（）和（）的植株均對SMV表現(xiàn)更好的抗性；雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）試驗表明，和與相互作用，同時和在的上游起作用；與相互作用，在的上游起作用[70]（表6）。

熱激蛋白在植物防御生物及非生物脅迫中具有至關(guān)重要的作用，Liu等[71]研究發(fā)現(xiàn)沉默具有DnaJ結(jié)構(gòu)域的大豆熱激蛋白基因Seo等[72]通過大豆與SMV互作研究表明大豆2C型蛋白磷酸酶基因（）是介導(dǎo)的對SMV抗性中的一個調(diào)控因子。

Zhou等[73]研究表明在多施鉀肥的情況下能夠提高大豆對SMV的抗性，過表達(dá)大豆鉀離子通道基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因陽性植株對SMV的抗性明顯增強(qiáng)。其可能的原因是大豆的過量表達(dá)導(dǎo)致其韌皮部發(fā)生改變，進(jìn)而不利于外部病毒的侵染、移動和復(fù)制[73]。轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)SMV對過表達(dá)大豆硝酸還原酶及黃嘌呤脫氫酶輔助因子轉(zhuǎn)基因植株的侵染率顯著低于對照品種，轉(zhuǎn)基因植株顯著增強(qiáng)大豆對SMV株系的抗性[74]。

、和在抗感品種間表達(dá)量有顯著差異且具有NB-LRR抗病基因保守結(jié)構(gòu)域，它們被作為抗病基因R的3個候選基因。Li等[75]研究發(fā)現(xiàn)，沉默3個基因后的抗病品種顯著感病，3個基因在抗感品種間的序列比對發(fā)現(xiàn)它們在抗感品種間均有氨基酸上的差異，推測這3個基因與大豆對SMV的抗病均有關(guān)系[75]。

Tran等[76]對的候選基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在缺失基因型的大豆品種中過量表達(dá)基因后SMV的侵染被明顯抑制；而對攜帶基因型的大豆品種L29進(jìn)行瞬時沉默后發(fā)現(xiàn)，原來對L29不致病的病毒株系表現(xiàn)較多的SMV積累[76]。將SMV抗病候選基因過表達(dá)轉(zhuǎn)化到擬南芥和大豆中，He等[68]發(fā)現(xiàn)與對照相比，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株能夠增強(qiáng)對蘿卜花葉病毒的抗性，轉(zhuǎn)基因大豆植株能夠增強(qiáng)對SMV的抗性。

通過酵母雙雜交和VIGS研究發(fā)現(xiàn)，大豆轉(zhuǎn)錄延伸因子家族（）蛋白基因能夠增進(jìn)SMV的復(fù)制，調(diào)控病原侵染；沉默該基因可降低SMV的積累，提高大豆對SMV的抗性[77]。敲除大豆真核翻譯起始因子（），Chen等[78]研究發(fā)現(xiàn)植株減少了系統(tǒng)過敏性壞死反應(yīng)，病毒積累增強(qiáng)，說明在介導(dǎo)的對SMV株系G7的系統(tǒng)過敏性壞死反應(yīng)信號通路中起重要作用。

5 SMV抗病候選基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

對介導(dǎo)的極端抗性（extreme resistance，ER）候選基因、和進(jìn)行沉默，Zhang等[79]研究發(fā)現(xiàn)沉默后的植株表現(xiàn)感病，由介導(dǎo)的ER喪失。同時，通過VIGS研究發(fā)現(xiàn)基因、、、、和2個WRKY轉(zhuǎn)錄因子（和）都參與了介導(dǎo)的抗性[79]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果并結(jié)合以前的研究，Zhang等[79]形成了一個由介導(dǎo)的ER調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：其中non-TIR-NBS-LRR基因及熱激蛋白基因和伴侶蛋白基因和位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)頂端，和脂肪酶位于的下游但在轉(zhuǎn)錄因子的上游，和最有可能在與和到轉(zhuǎn)錄因子的通路中是平行起作用的，最終表現(xiàn)對SMV的極端抗性（圖4-a）。

Seo等[72]構(gòu)建了一個介導(dǎo)對SMV的ER調(diào)控模型：在大豆最初感染的細(xì)胞中，SMV復(fù)制并產(chǎn)生效應(yīng)因子。通過R蛋白識別，從而導(dǎo)致激素脫落酸（abscisic acid，ABA）在大豆體內(nèi)的積累，進(jìn)而激活A(yù)BA信號通路。ABA信號通路與介導(dǎo)的極端抗性相關(guān)聯(lián)，通過上調(diào)信號傳導(dǎo)正調(diào)控因子，進(jìn)而刺激胼胝質(zhì)沉積。最終，在胞間連絲處的胼胝質(zhì)沉積抑制病毒從最初侵染的細(xì)胞向健康細(xì)胞的移動并限制病毒的積累[72,81]（圖4-b）。

灰色字體的基因由Fu等[80]鑒定 Genes indicated in gray were identified by Fu et al.[80]

通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析，He等[68]研究發(fā)現(xiàn)，該基因主要參與植物抗病的信號傳導(dǎo)和免疫反應(yīng)，而且在轉(zhuǎn)基因大豆中發(fā)現(xiàn)另外一個與SMV抗性相關(guān)的基因也能夠上調(diào)表達(dá)，表明這兩個基因協(xié)同提高大豆對SMV的抗性。

6 展望

近年來，隨著對大豆抗SMV研究的不斷深入，在抗病基因的分子標(biāo)記及候選基因的鑒定方面取得很大的進(jìn)展。在大豆第2、6、13和14染色體上研究發(fā)現(xiàn)的SSR、SNP、Indel等分子標(biāo)記與SMV抗病基因之間均緊密連鎖或共分離，為分子標(biāo)記輔助選擇及分子設(shè)計育種奠定了良好的基礎(chǔ)。Ma等[31]研究表明：單獨(dú)使用標(biāo)記Satt334或Sct_033對R在齊黃22×南農(nóng)1138-2的3個世代以及對R在齊黃1號×南農(nóng)1138的2個世代分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確率均在85%以上，同時使用2個標(biāo)記的準(zhǔn)確率達(dá)95%以上。Saghai Maroof等[82]、Shi等[83]和Wang等[84]利用與SMV抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記均成功地將分布在3條不同染色體上抗病基因精準(zhǔn)地聚合在同一個大豆品系中，為廣譜高抗SMV育種提供了優(yōu)異的抗源材料。

齊黃1號對中國的18個SMV株系和美國的7個株系均具有抗性[53-55]，其所攜帶的單顯性抗病基因均定位在第13染色體上[11,32,39-40,45]。鄭桂杰[85]收集整理骨干親本齊黃1號的衍生品種（系）發(fā)現(xiàn)，齊黃1號在全國11個省市衍生出92個高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種和優(yōu)異品系，其中黃淮海地區(qū)衍生出87個品種（系）[86]。通過對90個衍生品種（系）接種SC3和SC7發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)上大面積推廣的品種徐豆1號、躍進(jìn)5號、中黃19、豫豆19和齊黃22等對兩個株系均表現(xiàn)抗病[85]。此外，對SMV具有廣譜抗性的科豐1號及大白麻的衍生品種在生產(chǎn)上的推廣也對控制SMV的危害起到了關(guān)鍵的作用[87]。

然而，在日本和韓國相繼發(fā)現(xiàn)了使具有單個抗病基因的品種失去抗性的SMV毒株[88-90]，特別是在加拿大發(fā)現(xiàn)的SMV分離物L(fēng)-RB能夠攻克對美國所有7個株系都表現(xiàn)抗病的基因[91]。最近，WANG等[92]研究發(fā)現(xiàn)大豆花葉病毒P3蛋白單個氨基酸的改變就能使無毒株系攻克的抗性而成為致病株系。此外，中國報道的強(qiáng)致病株系及一些新發(fā)現(xiàn)的株系和重組株系也預(yù)示著SMV與大豆寄主之間一直處在動態(tài)平衡中[53-54,93-95]。因此，持續(xù)尋找新的抗病材料并發(fā)掘新的抗病基因是抗SMV育種的一個長期目標(biāo)。

中國是大豆的起源地，不僅具有大量的栽培大豆類型，而且野生資源豐富多樣，目前發(fā)現(xiàn)的野生大豆占世界90%以上[96]。Wen等[97]通過野生大豆與地方品種的遺傳多樣性比較發(fā)現(xiàn)，野生大豆中僅有51%的等位基因在地方大豆品種中保留下來，大豆的重測序研究結(jié)果也印證了這一發(fā)現(xiàn)[98]?？梢?，經(jīng)過多次馴化和人工選擇，野生大豆中大量優(yōu)異的遺傳變異沒有保留在栽培大豆中[97-98]。因此，利用野生大豆資源，發(fā)掘新的SMV抗病基因，對減少SMV危害，提高抗SMV育種成效具有關(guān)鍵性的作用。

大豆抗SMV的研究為確定SMV抗病基因和闡明大豆抗SMV調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了扎實的基礎(chǔ)[27-28,42-46]。以往由于大豆遺傳轉(zhuǎn)化及再生比較困難，對SMV抗病基因的功能驗證研究較少[68,73,76]。目前，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用不斷完善的大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)、候選基因沉默技術(shù)及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)等，對標(biāo)記定位的SMV抗病候選基因進(jìn)行功能驗證，對盡快確定抗SMV過程中的關(guān)鍵基因?qū)l(fā)揮重要作用。此外，從SMV侵染大豆的角度出發(fā)，研究者篩選出一些能夠協(xié)助SMV侵染大豆的基因，通過沉默這些基因發(fā)現(xiàn)，大豆增強(qiáng)了對SMV的抗性[77-78]。因此，后期如果能夠通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對研究發(fā)現(xiàn)的這些基因或一些新發(fā)現(xiàn)的負(fù)調(diào)控關(guān)鍵因子進(jìn)行改造，將是培育高效廣譜抗SMV大豆品種的一個新途徑。

解決抗SMV育種最根本的方法是在明確SMV抗病基因功能的基礎(chǔ)上，闡明大豆抗SMV過程中調(diào)控的信號網(wǎng)絡(luò)。SMV抗病基因的標(biāo)記定位及分析對理解大豆抗SMV的調(diào)控信號網(wǎng)絡(luò)以及發(fā)掘新的大豆抗病基因具有重要價值。Zhang等[79]和Seo等[72]對SMV抗病基因和在抗病過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了構(gòu)建和模擬，為進(jìn)一步驗證提供了重要線索。因此，探索大豆抗SMV的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及對大豆的抗病性進(jìn)行改良也是一個很重要的研究方向。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Progresses of Resistance on Soybean Mosaic Virus in Soybean

WANG DaGang1, LI Kai2, ZHI HaiJian2

(1Crop Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Quality Improvement of Anhui Province, Hefei 230031;2Soybean Research Institute of Nanjing Agriculture University/National Center for Soybean Improvement/ National Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095)

Soybean mosaic virus disease, caused by soybean mosaic virus (SMV), is one of the most serous pathogens of soybean ((L.) Merr.), which give rise to the loss of yield and quality in soybean production worldwide. During the recent decade, the studies on soybean against SMV stress have made some progress, includes the mapping of SMV resistant genes, the functional analysis of candidate resistance genes, and the progress in dissecting the SMV resistant signaling pathways in soybean. There are two kinds of resistance to SMV in soybean, quantitative resistance and qualitative resistance. The quantitative resistance to SMV is controlled by an additive major gene plus additive-dominant polygenes, and the qualitative resistance is mainly controlled by a dominant resistance gene. Research showed that the quantitative trait loci (QTL) were mainly on chromosome 6, 10 and 13. So far, 22 SMV qualitative resistance loci have been successively mapped on soybean chromosome 2, 6, 13 and 14. And most of the physical distance between the markers on both sides of the SMV resistance gene loci is within 1 Mb. Among them, there are 8 gene loci (,R,R,RandRetc.) located on chromosome 2, 10 loci (,,R,RandRetc.) on chromosome 13, 2 loci on chromosome 6 (RandR) and 14 (andR), respectively. According to the Williams 82 whole genomic sequence (http://www.phytozome.net/soybean), the putative candidate genes of SMV qualitative resistance loci were subsequently narrowed down based on their predicted functions, expression patterns and sequence comparison etc. Among these genes,,,,,,andet al. eight genes were considered potential resistance candidate genes to SMV on chromosome 2;as the most promising candidate gene on chromosome 6;,,,,,,,,et al. nine genes and,,,,,et al. six genes were the putative candidate genes to SMV on chromosome 13 and 14, respectively. Using virus induced gene silencing (VIGS) and transgenic technology etc. analyzed the functions of the candidate genes. The results showed genes,andcan participate to SMV resistance in soybean as positive regulator. After knocked downand, viral accumulation level of SMV and pathogenicity increased. They were considered negative regulator to SMV resistance. Based on the research results of SMV resistance gene, regulated model were built forandmediating extreme resistance (ER) against SMV.-mediated ER has provided new insight into the soybean signaling network required for ER against SMV. The primary mechanism of-mediated ER against viruses was the inhibition of viral cell-to-cell movement by callose deposition in an ABA signaling-dependent manner. In this report, the research progress on the mapping and function analysis of SMV resistance genes and the future research directions of SMV resistance in soybean are summarized. It will provide a basis for molecular design breeding and mechanism research of resistance genes to SMV in soybean.

soybean; soybean mosaic virus; resistance gene; marker location; functional research

2018-04-07；

2018-06-05

國家自然科學(xué)基金（31571687、31571690和31201235）、安徽省自然科學(xué)基金（1708085MC69）、國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-04）、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心（JCIC-MCP）

王大剛，Tel：0551-65149851；E-mail：smvwang@163.com。

智海劍，Tel：025-84396463；E-mail：zhj@njau.edu.cn