張文 李少軍 郭楠楠 趙英男

肺癌是目前對人類健康和生命威脅最嚴重的腫瘤之一。肺腺癌（lung adenocarcinoma）是肺癌的一種，屬于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），在女性及不抽煙者中較為常見[1,2]。lincRNA是一類長度大于200個堿基的具有生物學功能的非編碼RNA，已發(fā)現有大量的lincRNA在腫瘤組織中的異常表達以及癌變或者腫瘤的抑制存在一定的聯(lián)系，可被用作癌癥的生物標志物[3,4]。在肺腺癌中已經發(fā)現有一些lincRNA如EINCR1、MALAT1、HOTAIR和P21等的異常表達影響癌癥的進程[5-8]，然而其具體的調控機制目前還需進一步研究。

DNA甲基化是染色質修飾的一種，在不改變DNA序列的情況下，能改變染色質結構，進而影響周圍基因的表達。DNA甲基化能對原癌基因和抑癌基因的表達進行調控，在腫瘤發(fā)生過程中起十分重要的作用。原癌基因啟動子的DNA去甲基化能激活原癌基因的表達，進而導致癌癥的發(fā)生。如原癌基因MYC的啟動子DNA去甲基化與很多癌癥的發(fā)生發(fā)展有關[9-11]。而抑癌基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平的升高會抑制p53和Rb等抑癌基因的表達，進而促進了癌癥的發(fā)生發(fā)展[12,13]。

啟動子DNA甲基化能調控lincRNA基因的表達，與很多疾病的發(fā)生發(fā)展有關。在多種腫瘤細胞中發(fā)現lincRNA基因MEG3的表達顯著低于正常組織，其啟動子區(qū)域有DNA甲基化現象[14,15]。在肝癌細胞中，MEG3受mir-29a的間接調控。mir-29a能抑制甲基轉移酶的活性從而調控MEG3的表達。當用脫氧胞苷或RNA干擾的方法抑制甲基轉移酶時，MEG3的表達明顯上升[16]。另外在結直腸癌細胞系中發(fā)現，一些lincRNA基因在細胞用去甲基化試劑處理后，表達明顯上升[17]。肺腺癌中，系統(tǒng)研究DNA甲基化與lincRNA基因表達的關系及其對癌癥的影響相對較少。因此，本研究利用TCGA網站肺腺癌全基因組DNA甲基化芯片（infinium human methylation 450 beadChip）數據和轉錄組數據，分析兩者的關系及其在肺腺癌的變化和對預后的影響，為闡明lincRNA在肺腺癌中的可能調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據來源 從TCGA網站下載507例基于Illumina全基因組DNA甲基化芯片的肺腺癌DNA甲基化數據及594例肺腺癌RNA-seq轉錄組數據（2017年5月），同時下載患者的臨床結果數據。

1.2 方法

1.2.1 lincRNA基因周圍DNA甲基化水平的分析 DNA甲基化水平用芯片每個探針的?值表示。?值越高，表示甲基化水平越高，?的最大值為1，最小值為0。從Ensembl下載人類基因組注釋數據（GRCh38），根據lincRNA在基因組上的注釋數據，對于啟動子上游2,000 bp和基因下游2,000 bp區(qū)域，每100 bp計算癌旁組織中探針的平均DNA甲基化水平。在基因區(qū)域，平均分成20個相同長度區(qū)域后，計算每個區(qū)域的平均甲基化水平。

1.2.2 轉錄組數據處理 下載RNAseq數據后，基因的表達值為FPKM，用分位數歸一化（quantile normalization）對數據進一步進行處理，計算癌旁組織每個基因的平均表達水平，然后按表達值高低把基因平均分成3類，計算不同表達水平基因的DNA甲基化水平。

1.2.3 DNA甲基化差異分析 對于每個基因轉錄起始位點上游1,000 bp區(qū)域，用配對t檢驗的方法計算每個探針在腫瘤組織和癌旁組織間DNA甲基化水平的差異。P值用Bonferroni進行多重矯正后得到Q值同時計算兩種組織間平均?值差異。對于每個探針，如果Q＜0.05以及Δ?＞0.1，則認為該探針在兩種組織中DNA甲基化水平有顯著差異。如果一個基因上游區(qū)域有DNA甲基化差異的探針的甲基化水平都向同一方向變化，則認為該基因的啟動子DNA甲基化水平在兩種組織中有顯著差異

1.2.4 基因表達差異分析 用配對t檢驗的方法計算每個基因在腫瘤組織和癌旁組織間基因表達水平的變化，P值用Bonferroni進行多重矯正后得到Q值，Q＜0.05作為基因顯著差異的閾值。

1.2.5 生存分析 對356例既有DNA甲基化數據，也有臨床病理特征及預后信息的標本，根據lincRNA基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平，對肺腺癌患者的預后進行生存分析。總生存時間定義為手術至患者死亡或末次隨訪的時間。生存分析在R中進行，采用的工具包為Survival包，不同DNA甲基化水平患者的生存時間差異用survdiff進行統(tǒng)計。

2 結果

2.1lincRNA基因DNA甲基化分析 從TCGA下載人類肺腺癌的全基因組450 K DNA甲基化芯片數據，根據Ensembl的基因注釋，計算癌旁組織lincRNA基因周圍DNA甲基化的分布情況。與以前的結果類似，在蛋白基因的基因區(qū)域有著較高的DNA甲基化水平，而離轉錄起始位點較近的上游區(qū)域DNA甲基化水平相對較低（圖1A）。DNA甲基化在lincRNA基因的分布情況與蛋白基因相近，其基因區(qū)域的DNA甲基化水平較高，而轉錄起始位點附近的啟動子區(qū)域DNA甲基化水平較低（圖1A）。然而，DNA甲基化在這兩種基因上的分布情況存在一定的差異，在基因區(qū)域蛋白基因的DNA甲基化水平顯著高于lincRNA基因，而在靠近轉錄起始位點的啟動子區(qū)域蛋白基因的DNA甲基化水平低于lincRNA基因（圖1A）。

為了研究DNA甲基化對lincRNA基因表達的影響，從TCGA下載507個包括肺腺癌腫瘤組織和癌旁組織的RNA-seq數據，用分位數歸一化后計算腫瘤組織和癌旁組織的lincRNA基因平均表達水平，同時利用癌旁組織計算不同表達水平的lincRNA基因DNA甲基化情況。從圖1B可以看出，不同表達水平的lincRNA基因在轉錄位點上游區(qū)域的DNA甲基化存在明顯差別，該處的DNA甲基化對lincRNA的基因表達有抑制作用。不同表達水平的lincRNA基因區(qū)域的甲基化水平沒有明顯的差異，表明該位置的DNA甲基化并不影響lincRNA的表達。

圖 1 lincRNA基因周圍DNA甲基化分布分析。A：lincRNA基因和蛋白基因周圍DNA甲基化分布；B：不同表達水平的lincRNA基因DNA甲基化分布。Fig 1 Distribution of DNA methylation around lincRNA.A: Distribution of DNA methylation around lincRNAs and proteins; B: Distribution of DNA methylation in lincRNAs with different expression levels.

2.2 腫瘤組織和癌旁組織間lincRNA存在DNA甲基化差異 為了研究lincRNA的DNA甲基化對肺腺癌的影響，對23例同時含有腫瘤組織和癌旁組織的肺腺癌患者lincRNA基因的啟動子DNA甲基化進行差異分析。用配對t檢驗的方法計算每個探針在腫瘤組織和癌旁組織間DNA甲基化水平的差異，共發(fā)現420個lincRNA基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平存在顯著差異（矯正后的P＜0.05，Δ?＞0.1）。其中有280個lincRNA基因在腫瘤組織中啟動子的DNA甲基化水平明顯高于癌旁組織。如圖2所示，420個基因的啟動子區(qū)域DNA甲基化熱圖聚類分析表明，腫瘤組織和癌旁組織的樣本分別聚在不同的分支上，表明兩者的DNA甲基化存在明顯差別。同時，大部分腫瘤組織的DNA甲基化水平明顯高于癌旁組織。

2.3 DNA甲基化影響肺腺癌患者的lincRNA基因表達在420個有啟動子DNA甲基化變化的lincRNA中，比較23例同時含有腫瘤組織和癌旁組織肺腺癌病人的lincRNA基因表達變化時發(fā)現，有270個基因的表達變化趨勢與甲基化相反。用配對t檢驗的方法計算表明，在兩種組織中，這270個lincRNA有15個基因的表達有十分顯著的差異（Bonferroni多重矯正后結果），其中有5個lincRNA基因的啟動子DNA甲基化水平變高，而其基因表達水平變低，另外10個lincRNA基因的啟動子DNA甲基化水平變低，而其基因表達水平變高（圖3）。表明這15個lincRNA基因中啟動子DNA甲基化的變化影響基因的表達。

圖 2 腫瘤組織和癌旁組織lincRNA基因啟動子DNA甲基化聚類分析Fig 2 Heatmap analysis of DNA methylation in promoter region of lincRNA in tumor and adjacent tissues

圖 3 腫瘤組織和癌旁組織lincRNA基因啟動子DNA甲基化變化與基因表達變化關系Fig 3 Comparative analysis of DNA methylation in the promoter region of lincRNA and its contribution to gene expression between tumor and adjacent tissues

2.4lincRNA基因啟動子DNA甲基化水平的變化與肺腺癌患者生存時間有關 在15個啟動子有DNA甲基化變化同時基因表達受到影響的lincRNA基因中，FGF14-AS2是一個抑癌基因，其表達降低與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關[18]。另一個lincRNA基因FENDRR也是一個抑癌基因，其表達降低與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關[19]。為了進一步研究lincRNA基因啟動子DNA甲基化對肺腺癌患者的影響，對于這15個基因，按其啟動子DNA甲基化水平，把含有完整預后信息的356個患者分成高甲基化和低甲基化兩組，用R軟件中的Survival包計算兩者的生存曲線。在這15個lincRNA基因中，有2個基因的DNA甲基化水平與生存時間相關，為AC092171.5和FENDRR基因。在這兩個基因中，低甲基化患者相對于高甲基化患者有較長的生存期（圖4A，P＜0.05），該趨勢剛好與基因表達相反（圖4B，P＜0.05）。

3 討論

本研究應用生物信息學手段，通過分析公用數據庫TCGA的人肺腺癌全基因組DNA甲基化數據和RNA-seq數據，發(fā)現lincRNA基因啟動子區(qū)域與基因組區(qū)域相比有較低的DNA甲基化現象，一部分lincRNA基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平在腫瘤組織和癌旁組織間存在明顯差別，能調控基因的表達。本研究中，在420個有DNA甲基化水平差異的lincRNA中，有270個基因的表達變化趨勢相反。通過統(tǒng)計檢驗雖然只有15個變化趨勢相反的基因在兩種組織中表達值有顯著差異，這可能與我們的統(tǒng)計檢驗方法較為嚴格有關。當用較為寬松的Benjamini-Hochberg多重矯正方法時，我們發(fā)現130個基因有顯著表達差異（矯正后P＜0.05）。另外，一些lincRNA基因啟動子DNA甲基化水平與患者的預后有關，包括FENDRR和AC092171.5。

FENDRR基因位于16q24.1，能結合到PRC2蛋白復合體（polycomb repressive complex 2）上，調控目標基因的表達[20]。在多種腫瘤中發(fā)現，FENDRR的表達顯著低于正常組織，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，然而其具體的調控機制并不清楚[19,21]。最近有研究[22]發(fā)現，在肺癌中，FENDRR能調控腫瘤抑制基因FOXF1的表達，與肺癌的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系。通過本文的研究發(fā)現，腫瘤組織中該基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化顯著升高，因而抑制了基因的表達，從而導致其下游所調控的與癌癥發(fā)生發(fā)展相關的基因表達發(fā)生了變化。另外，該基因啟動子DNA甲基化水平越高的患者預后越差，因此該基因的啟動子甲基化可能跟肺腺癌的發(fā)生發(fā)展以及預后都有關系，可以作為肺腺癌診斷和預后的一個潛在標志物。AC092171.5啟動子DNA甲基化水平在腫瘤組織中顯著低于癌旁組織，然而，高甲基化患者預后較差，表明該基因的DNA甲基化與預后也有一定的聯(lián)系。

越來越多的數據表明DNA甲基化與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。在肺癌患者中已發(fā)現一部分蛋白基因的啟動子區(qū)域存在甲基化現象。p16基因是一種重要的抑癌基因，參與細胞周期蛋白調控。在腫瘤組織中，該基因啟動子區(qū)CpG島甲基化能降低其表達水平，在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[23,24]。研究發(fā)現，隨著癌癥的發(fā)展，肺腺癌中一些基因的DNA甲基化水平也會產生明顯的改變。從正常組織到肺腺癌的發(fā)展過程中，這些基因的甲基化程度明顯增加[25]。因此，檢測DNA甲基化的變化在肺腺癌早期診斷和風險評估有著十分重要的意義。另外，細胞的高轉移特性可能與一些基因的高甲基化相關，DNA甲基化的變化對預測疾病的復發(fā)具有一定的意義，可作為預后效果的一個重要指標[26]。

圖 4 lincRNA基因啟動子DNA甲基化和基因表達水平與肺腺癌患者的生存時間關系。A：DNA甲基化；B：基因表達。Fig 4 Survival analysis of patients with different methylation levels in lung adenocarcinoma.A: DNA methylation; B: Gene expression.

綜上，一些lincRNA基因啟動子區(qū)域的高甲基化會抑制基因的表達，是其表達的重要調控機制之一。FENDRR基因啟動子區(qū)域的甲基化可以作為肺腺癌診斷及預后的一個重要指標，該結果同時為進一步研究肺腺癌發(fā)病機制提供新的線索。