納 嶸，胡 波，史 蓓

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大北農(nóng)科技實業(yè)有限公司，寧夏 銀川 750200）

優(yōu)質(zhì)牧草是草畜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要保障，作為牧草產(chǎn)業(yè)發(fā)展首選的牧草之一，苜蓿是世界上栽培面積最廣的牧草，素有“牧草之王”的美譽(yù)。苜蓿莖葉中含有豐富的蛋白質(zhì)、粗纖維、礦物質(zhì)、維生素和多種氨基酸等營養(yǎng)成分，是優(yōu)質(zhì)的粗飼料，同時也是精飼料的良好替代品和配合飼料的原料［1-2］。苜蓿眾多營養(yǎng)成分中，蛋白質(zhì)含量是衡量苜蓿營養(yǎng)價值的一個核心指標(biāo)。

近年來，國家對飼料營養(yǎng)成分分析及動物營養(yǎng)的工作十分重視，目前在國內(nèi)已建立了飼料營養(yǎng)成分的數(shù)據(jù)庫。但由于飼料來源途徑多樣，原料采購標(biāo)準(zhǔn)難以實行，而常規(guī)分析方法耗時長、操作復(fù)雜、重復(fù)性差，已不適應(yīng)畜牧業(yè)精細(xì)化、科學(xué)化發(fā)展的需要［3］。

近紅外光譜分析是主要用于有機(jī)物質(zhì)定性和定量分析的一種分析技術(shù)，是國內(nèi)外發(fā)展較快的一種新型定性、定量分析技術(shù)。通過各類飼料定標(biāo)曲線，可以檢測從原料到成品飼料中的水分、淀粉、脂肪、蛋白、纖維、氨基酸、鈣、磷、鹽分等指標(biāo)。其具有一次分析項目多，分析快速準(zhǔn)確 （分析時間<1 min），無需樣品前處理（化學(xué)處理），減少和降低化學(xué)試劑對環(huán)境的污染，且具有不破壞樣品無損分析的特點，從而滿足用戶快速、準(zhǔn)確的飼料檢測需求［4-7］。

在草畜產(chǎn)業(yè)中，飼料化學(xué)成分檢測是保證飼料產(chǎn)品質(zhì)量與安全的重要技術(shù)手段之一［8］，因此，該研究擬采用近紅外光譜技術(shù)掃描、收集苜蓿樣品的近紅外光譜，將樣品的蛋白質(zhì)含量值與相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，利用化學(xué)計量學(xué)方法，建立預(yù)測性能良好、準(zhǔn)確可靠的苜蓿蛋白質(zhì)快速定量預(yù)測模型，從而實現(xiàn)苜蓿蛋白質(zhì)含量的快速測定，為近紅外光譜技術(shù)在飼料分析檢測中的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)，并為發(fā)展牧草快速檢測技術(shù)提供新思路和新方法，進(jìn)一步推動草畜產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與試驗試劑

1.1.1 儀器設(shè)備：近紅外光譜分析儀DS2500F（丹麥Foss公司）；KDN-04A蛋白質(zhì)測定儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）；試樣粉碎機(jī)（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）；KND-20C消化爐（上海華睿儀器有限公司）。

圖1 技術(shù)路線圖

1.1.2 試驗試劑：鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銨、硼酸、硫酸、硫酸銅、無水硫酸鈉、溴甲酚綠、甲基紅等。

1.2 試驗材料

從2016年10月—2018年5月，共收集苜蓿干草樣品63個，所有樣品粉碎至90%以上，并通過0.425 mm的樣品篩。選取其中的52個樣品形成定標(biāo)集，用以建立苜蓿蛋白質(zhì)含量快速分析定標(biāo)模型；其余11個樣品組成樣品驗證集，用以驗證定標(biāo)模型準(zhǔn)確性。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品成分的化學(xué)分析：采用凱氏定氮法（GB/T 6432—94）和蛋白質(zhì)測定儀測定苜蓿樣本集蛋白質(zhì)含量。每個樣品測定3次平行樣本，取平均值作為化學(xué)測定值［9］。

1.3.2 樣品的光譜掃描：分別掃描63個苜蓿樣品（在1 100～2 498 nm波長范圍內(nèi)），每隔2 nm采集1次反射量（R），每份樣品重復(fù)掃描4次，取平均值。使用光譜分析軟件Win ISIⅢ對掃描后的光譜進(jìn)行預(yù)處理和回歸統(tǒng)計分析。

1.3.3 模型的建立和驗證：采用FOSS公司W(wǎng)in ISIⅢ近紅外光譜分析軟件，將苜蓿定標(biāo)集的蛋白質(zhì)含量化學(xué)值與光譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，分析建立的苜蓿蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型。通過內(nèi)部驗證和外部驗證兩種形式，評價定標(biāo)模型的性能。內(nèi)部驗證以交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）和交叉驗證相關(guān)系數(shù)（1-VR）評價定標(biāo)模型質(zhì)量優(yōu)劣程度，交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）越小，交叉驗證相關(guān)系數(shù)（1-VR）越大，證明模型的預(yù)測性能越好；外部驗證利用驗證集比較苜蓿驗證集樣品的模型預(yù)測值與測定值相關(guān)性，通過預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）評價模型預(yù)測性能，預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）越小，定標(biāo)模型的預(yù)測性能越好［10］。

表1 苜蓿樣品中蛋白質(zhì)含量的化學(xué)分析結(jié)果

圖2 苜蓿樣本原始光譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿樣品蛋白質(zhì)含量的常規(guī)化學(xué)分析

按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 6432—94），使用蛋白質(zhì)測定儀對苜蓿樣品蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，并對其分析。由表1可知，苜蓿樣品中蛋白質(zhì)含量變化幅度較大，說明苜蓿樣品來源較廣泛，具備一定的代表性，可用來建立苜蓿蛋白質(zhì)含量的近紅外光譜預(yù)測模型。

2.2 樣品的近紅外光譜圖與處理分析

圖2為苜蓿樣品經(jīng)近紅外光譜分析儀得到的近紅外原始光譜圖，其中橫坐標(biāo)代表光譜波長（nm），縱坐標(biāo)為苜蓿樣本的吸光度。對其分析可知苜蓿樣品在1 100～2 498 nm的波長范圍內(nèi)有明顯的吸收峰和基本相同的變化趨勢，說明苜蓿樣品的吸光度與其化學(xué)成分含量存在線性相關(guān)性，苜蓿的近紅外原始光譜圖可作為建立蛋白質(zhì)含量快速檢測模型。

對原始光譜圖進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理后，可得到一階導(dǎo)數(shù)處理后光譜。如圖3所示，處理后的光譜消除噪聲影響，吸收峰更加明顯［11］。

2.3 定標(biāo)模型的建立和驗證

2.3.1 苜蓿蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型的建立：使用Win ISIⅢ近紅外光譜分析軟件，確定光譜數(shù)學(xué)處理方式為“1，4，4，1”，即導(dǎo)數(shù)處理采用一階導(dǎo)數(shù)處理，導(dǎo)數(shù)處理數(shù)據(jù)間隔為4，平滑處理間隔為4，二次平滑處理間隔為1。將苜蓿蛋白質(zhì)含量的化學(xué)分析值與光譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，采用改進(jìn)最小二乘回歸法 （MPLS），建立苜蓿蛋白質(zhì)含量分析定標(biāo)模型。

圖3 一階導(dǎo)數(shù)處理后光譜圖

2.3.2 苜蓿蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型的內(nèi)部交叉驗證：對苜蓿蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型進(jìn)行內(nèi)部交叉驗證，分析內(nèi)部交叉驗證效果，其中交叉驗證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）為 0.433 5，交叉驗證相關(guān)系數(shù)（1-VR）為0.920 1，1-VR＞0.90。證明苜蓿蛋白質(zhì)含量化學(xué)分析值和光譜預(yù)測值之間具有一定的線性相關(guān)性，本次建立的苜蓿近紅外定標(biāo)模型具有較好的預(yù)測性能。

2.3.3 苜蓿蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型的外部驗證：對已建立的苜蓿蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型進(jìn)行外部驗證，利用驗證集比較苜蓿驗證集樣品的模型預(yù)測值與測定值相關(guān)性。經(jīng)過驗證，預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）為0.264 0。如圖4所示，苜蓿驗證集的光譜預(yù)測值與化學(xué)測定值之間有較好的線性相關(guān)關(guān)系，說明定標(biāo)模型可以較好地預(yù)測苜蓿蛋白質(zhì)含量。

如上所示，通過對模型的內(nèi)部交叉驗證和外部驗證后，說明苜蓿蛋白質(zhì)含量的近紅外定標(biāo)模型具有較好的預(yù)測性能。

3 討論與結(jié)論

該試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，采用改進(jìn)最小二乘回歸法（MPLS），數(shù)學(xué)處理方式為“1，4，4，1”，使用Win ISIⅢ光譜分析軟件建立苜蓿蛋白質(zhì)含量分析的預(yù)測模型。通過對已建立的苜蓿蛋白質(zhì)含量定標(biāo)模型進(jìn)行內(nèi)部交叉驗證和外部驗證，證明該定標(biāo)模型較穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確地對苜蓿的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行快速檢測分析，為近紅外光譜分析技術(shù)在飼料檢測領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

圖4 樣品驗證集的光譜預(yù)測值與化學(xué)測定值的關(guān)系