婁亞坤，任寶紅，張 杰，曾小宇，付燕峰，趙林萍

（鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南鄭州450000）

0 引言

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Syndrome Virus，PRRSV）引起的急性、高度傳染性疾病，俗稱“藍(lán)耳病”。PRRS現(xiàn)已遍布于全世界主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)，其中高致病性藍(lán)耳病屬于農(nóng)業(yè)部規(guī)定的“一類動(dòng)物疫病”，已經(jīng)嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。PRRSV為不分節(jié)段單股正鏈RNA，含有至少8個(gè)不分首尾重疊的開放閱讀框，分別編碼8種蛋白即：多聚蛋白 ppla、pplab，小囊膜蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4，囊膜蛋白 GP5，膜基質(zhì)蛋白 M和核衣殼蛋白 N［1］。

目前市場上，檢測PRRSV抗體多以核衣殼蛋白N、膜基質(zhì)蛋白等單一蛋白包被［2-5］。這就可能存在著樣品漏檢，感染初期檢測準(zhǔn)確率不高，病毒變異導(dǎo)致敏感性下降等缺陷。鑒于此，以N蛋白、M蛋白、GP5蛋白為單包或混包抗原，研究了最佳包被條件，建立初步的診斷方法，為PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬繁殖與呼吸綜合征疫苗（CH-1R株）抗原：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；pET-28a（+）Plasmid：武漢淼靈生物科技有限公司；感受態(tài)細(xì)胞 BL21（DE3）、Trizol、PCR SuperMix、逆轉(zhuǎn)錄酶TransScript Reverse Transcriptase、T4連接酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：Axygen公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker：TaKara公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組N蛋白、M蛋白、GP5蛋白、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG：洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；20份豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性標(biāo)準(zhǔn)血清及20份陰性標(biāo)準(zhǔn)血清由鄭州中道生物技術(shù)有限公司制備。

2 方法

2.1 PRRSV ELISA抗體檢測方法研究

2.1.1 抗原性蛋白單獨(dú)包被的最佳濃度與血清稀釋倍數(shù)的確定

采用方陣滴定法分別確定PRRSV N蛋白、M蛋白、GP5蛋白包被濃度和待檢血清的稀釋度。將N蛋白、M蛋白、GP5蛋白分別按 2.5 ng／孔、5 ng／孔、10 ng／孔、20 ng／孔的濃度倍比稀釋后進(jìn)行包被，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清按1∶5，1∶10，1∶20倍比稀釋，方陣滴定，進(jìn)行常規(guī)ELISA測定，選擇陽性血清與陰性血清 OD450 nm比值（P／N）值最大，且陰性血清OD450 nm較小的抗原濃度和血清稀釋度，從而確定單包最佳條件。

2.1.2 臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)確定

根據(jù)方陣試驗(yàn)結(jié)果，分別用N蛋白、M蛋白、GP5蛋白以最佳抗原包被濃度及最佳血清稀釋倍數(shù)，常規(guī)ELISA方法檢測PRRSV抗體陰性的血清20份N1～N20。記錄OD450 nm值，并計(jì)算平均值（X）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)3σ準(zhǔn)則，陰陽的臨界值為X+3SD。即OD450 nm≥X+3SD時(shí)，即為陽性。計(jì)算N蛋白、M蛋白、GP5蛋白的臨界值。

2.1.3 混合包被的條件選擇

2.1.3.1 抗原性蛋白單獨(dú)包被研究

用選定的N蛋白、M蛋白、GP5蛋白最適包被濃度分別包被抗原，常規(guī)ELISA方法，分別測定經(jīng)病毒中和試驗(yàn)確證的20份PRRSV抗體陽性標(biāo)準(zhǔn)血清樣本P1～P20，5份陰性標(biāo)準(zhǔn)血清樣本N1～N5，根據(jù)陰陽血清的臨界值，比較各血清樣本P／N值及陽性檢出率。

2.1.3.2 抗原性蛋白混合包被研究

根據(jù)單獨(dú)包被試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，將N蛋白作為主要包被蛋白，以N、M、GP5 3個(gè)蛋白的最佳包被濃度，分別按 1∶0.5∶0.5、1∶0.5∶1、1∶0.5∶1.5、1∶1∶0.5、1∶1∶1、1∶1∶1.5、1∶1.5∶0.5、1∶1.5∶1、1∶1.5∶1.5比例混合，分別作為包被抗原進(jìn)行包被，并制作包被板，檢測20份PRRSV抗體陽性血清樣本P1～P20，20份陰性血清樣本N1～N20，以N蛋白、M蛋白、GP5蛋白的最大臨界值判定，并比較各血清樣本檢出率，確定最佳包被抗原比例。

3 結(jié)果

3.1 抗原性蛋白的最佳包被濃度與血清稀釋倍數(shù)方陣滴定

試驗(yàn)結(jié)果表明，N蛋白的最佳包被濃度為以5ng／孔，PRRSV抗體陰陽性血清樣本1∶10稀釋；M蛋白最佳包被濃度為5ng／孔，PRRSV抗體陰陽性血清樣本1∶10稀釋；GP5蛋白最佳包被濃度為10ng／孔的濃度進(jìn)行包被，PRRSV抗體陰陽性血清樣本1∶10稀釋。

3.2 臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)確定

根據(jù)方陣試驗(yàn)結(jié)果，N蛋白、M蛋白、GP5蛋白分別以最佳包被條件及最佳血清稀釋倍數(shù)，常規(guī)ELISA方法檢測20份PRRSV陰性血清。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，計(jì)算N蛋白臨界值為0.194，M蛋白臨界值為 0.161，GP5蛋白臨界值為 0.199。

3.3 N蛋白、M蛋白、GP5蛋白最適條件測定結(jié)果

3.3.1 3種抗原性蛋白單獨(dú)包被結(jié)果

從表1可知，3種蛋白單獨(dú)包被反應(yīng)板，測定的陽性血清樣本及陰性血清樣本均出現(xiàn)漏檢情況，但漏檢樣本有互補(bǔ)。且其中N蛋白的P／N值最高且陽性檢出率最高（85.0%）。因此，以N蛋白為主包被蛋白，試驗(yàn)嘗試采用3種蛋白混合包被，研究最佳包被條件，以降低漏檢率。

表1 3種蛋白單獨(dú)包被測定結(jié)果 %

3.3.2 N蛋白、M蛋白、GP5蛋白不同濃度混合包被測定陰、陽性血清樣本結(jié)果

由N蛋白、M蛋白、GP5蛋白單獨(dú)包被的試驗(yàn)結(jié)果表明，N蛋白的最佳包被濃度為5 ng／孔，M蛋白的最佳包被濃度是5 ng／孔，GP5蛋白的最佳包被濃度為10 ng／孔；血清的最佳稀釋比例均為1∶10；以N蛋白為主包被蛋白，N、M、GP5 3種抗原性蛋白以各自的最佳包被濃度，按照不同的比例包被，由試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)N、M、GP5蛋白以單包最佳包被量比例為1∶1∶0.5時(shí)，即N蛋白、M蛋白、GP5蛋白包被量均為5ng／孔，陽性檢出率為100%，且陰性樣品假陽性檢出率為0。因此，N蛋白、M蛋白、GP5蛋白最佳的混包量均為5 ng∶5 ng∶5 ng／孔。

4 討論

N蛋白是PRRSV所有蛋白中表達(dá)量較高的蛋白，至少含有5個(gè)抗原表位，具有很強(qiáng)的免疫原性，因此N蛋白進(jìn)行病毒特異性抗體的檢測和疾病的診斷的靶抗原［6］。本研究中，以N蛋白單包的ELISA檢查陽性率最高（85.0%），因此以N蛋白為主包被蛋白。

M蛋白是PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白中穩(wěn)定性最強(qiáng)的一個(gè)，是最重要和最保守的結(jié)構(gòu)蛋白。GP5蛋白具有高度變異性，具有中和表位，是重要的免疫區(qū)域。

因此，本研究中以N蛋白為主包被蛋白，M蛋白、GP5蛋白為輔助蛋白混合包被，研究出了最佳包被濃度即N蛋白、M蛋白、GP5蛋白混包量均為5 ng∶5 ng∶5 ng／孔時(shí)，敏感性、特異性均為100%，有效避免了單獨(dú)包被抗原性蛋白出現(xiàn)的靈敏度低，漏檢或錯(cuò)檢的問題。

綜上所述，制備的檢測試劑可初步用于臨床PRRSV血清抗體的檢測，為今后PRRSV抗體ELISA檢測試劑的進(jìn)一步研制奠定了基礎(chǔ)。