張 毅，陳 斌，邵 靚，梁璐琪，周莉媛，鄧 飛，張 睿

（四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都610041）

0 引言

沙門菌屬是腸桿菌科的一個(gè)重要分支，臨床上主要引起敗血癥和腸炎，在我國沙門菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的70%～80%［1］。目前已發(fā)現(xiàn)超過2 500種血清型，危害較大的為鼠傷寒、腸炎以及豬霍亂沙門菌，消化道是感染的主要途徑。在生豬養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，沙門菌可以長期存活于水、土壤、動(dòng)物飼料、生肉及內(nèi)臟中，污染豬肉產(chǎn)品，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。

同時(shí)，由于養(yǎng)豬生產(chǎn)中的不合理用藥情況嚴(yán)重，使得細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益明顯，給豬細(xì)菌病防治和人類臨床用藥帶來巨大隱患。本研究通過調(diào)查四川12個(gè)地區(qū)20個(gè)規(guī)?；i場的沙門菌污染率，檢測分離菌的耐藥情況，為指導(dǎo)四川地區(qū)豬場合理用藥以及制定沙門菌耐藥性控制措施提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年8月—2018年4月，分別在四川省成都、綿陽等12個(gè)地區(qū)的20個(gè)規(guī)?；i場，用棉拭子采集臨床健康豬直腸糞便樣本和環(huán)境樣本。每個(gè)豬場不同階段健康豬采集30份樣本，豬場環(huán)境采集10份樣本，20個(gè)豬場總計(jì)800份。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

BPW培養(yǎng)基、TTB培養(yǎng)基、XLD瓊脂培養(yǎng)基、TSA瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；引物合成自生工（上海）生物工程有限公司；premix Taq（Ex Taq Version 2.0）購自大連寶生物工程有限公司；VITEK-2 AST-GN13藥敏卡購自四川德佩萊科技有限公司。

1.3 沙門菌分離培養(yǎng)

吸取200μL樣品接入3 mL BPW中進(jìn)行預(yù)增菌，37℃培養(yǎng)10h；吸取200μL預(yù)增菌液接入3mL TTB增菌液中，42℃培養(yǎng)24 h；用接種環(huán)蘸取適量增菌液劃線接種于XLD平板，37℃培養(yǎng)16 h；挑取可疑單菌落接種至XLD平板純化1次，37℃培養(yǎng)16 h；挑取可疑單菌落接種至TSA平板，37℃培養(yǎng)16 h，革蘭氏染色鏡檢，待用。

1.4 分離菌的invA基因PCR鑒定及16S rDNA測序

挑取平板中的單菌落，進(jìn)行invA基因和16S rDNA菌落PCR。invA基因菌落PCR使用的引物及擴(kuò)增程序參照Rahn K等［2］的報(bào)道，目的片段284 bp。16SrDNA片段菌落PCR使用通用引物 27F／1492R，擴(kuò)增程序：95℃ 5min；95℃ 30s，53℃30s，72℃ 90s，30次循環(huán)；72℃ 5 min，目的片段約 1450 bp，產(chǎn)物送生工（上海）生物工程有限公司測序，測序結(jié)果用NCBI的BLAST軟件（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）進(jìn)行序列比對，同源性≥98%判定為同種細(xì)菌。

1.5 分離菌的耐藥性檢測

使用梅里埃VITEK-2微生物自動(dòng)鑒定儀進(jìn)行耐藥性檢測，方法參考AST-GN13藥敏卡操作說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

從采集的800份樣本中分離到疑似沙門菌53株，染色鏡檢均為革蘭陰性短小桿菌、大小均一、多散在、無芽孢、無莢膜（圖1）。在XLD平板上，特征為中等大小菌落，帶有黑色中心或整個(gè)菌落呈金屬光澤的黑色，菌落周圍培養(yǎng)基呈粉紅色（圖2）。

圖1 疑似沙門菌的革蘭氏染色鏡檢（1000×）

圖2 疑似沙門菌在XLD平板上的菌落形態(tài)

2.2 invA基因菌落PCR鑒定

53個(gè)疑似菌株均得到長度約為280bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，部分菌株的擴(kuò)增條帶（見圖3）。

2.3 16S rDNA菌落PCR及測序

53個(gè)疑似菌株均得到長度約為1.5kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，部分菌株的擴(kuò)增條帶（見圖4）。BLAST比對結(jié)果顯示，53個(gè)疑似菌株與沙門菌屬菌株的相似度均≥98%。

圖3 部分疑似沙門菌invA基因菌落PCR鑒定結(jié)果

圖4 部分疑似沙門菌16SrDNA菌落PCR鑒定結(jié)果

2.4 豬場沙門菌陽性率

在四川省12個(gè)地區(qū)的600份健康豬樣本、200份環(huán)境樣本中，共分離到53株沙門菌，檢出率為6.6%（53／800），豬糞樣本中檢出率8.17%（49／600），環(huán)境樣本中檢出率2%（4／200）。各地區(qū)豬場的檢出率見表1。

表1 四川12個(gè)地區(qū)豬場沙門菌檢測率

2.5 耐藥性檢測

53株沙門菌對18種藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥率0%～92.45%，結(jié)果見表2。對氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、慶大霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明的耐藥性較高，耐藥率81.13%～92.45%。對頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、厄他培南、左氧氟沙星的耐藥性較低，耐藥率0%～24.53%。

表2 分離菌對不同抗菌藥的耐藥情況

3 討論

目前，沙門菌的分離培養(yǎng)方式較多，分離效果也各不相同，本研究采用BPW預(yù)增菌、TTB選擇性增菌、XLD平板選擇性培養(yǎng)獲得疑似菌株，再通過革蘭氏染色、invA基因檢測、16S rDNA測序?qū)σ伤凭赀M(jìn)行鑒定，從800份四川地區(qū)規(guī)?；i場樣本中，分離出53株沙門菌，分離率6.63%。不同地區(qū)、或是相同地區(qū)不同時(shí)期的沙門菌分離率受多種因素影響，如分離方法、豬場抗菌藥物使用情況、采樣時(shí)間等，不過總體來看，本研究結(jié)果與四川省2014年報(bào)道的分離率4.5%［3］，以及我國其他地區(qū)的報(bào)道（哈爾濱 5.83%［4］、安徽 6.11%［5］）分離率相近。調(diào)查的12個(gè)地區(qū)中，沙門菌檢出情況比較平均，其中宜賓和樂山兩地區(qū)的分離率略高于其他地區(qū)。

耐藥檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙門菌分離株對不同類型藥物的耐藥性差異明顯，18種藥物中，對氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、慶大霉素、妥布霉素復(fù)方新諾明的耐藥率較高，特別是氨芐西林和復(fù)方新諾明的耐藥率超過90%，與國內(nèi)學(xué)者報(bào)道的全國水平的沙門菌耐藥情況相似，焦連國等［6］對分離自全國的128株豬沙門菌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)氨芐西林和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為84.38%和100%，而朱順等［7］對全國范圍分離的55株豬沙門菌的檢測發(fā)現(xiàn)，氨芐西林和磺胺異噁唑的耐藥率分別為87.27%和74.55%，由于青霉素類和磺胺類藥物是我國獸醫(yī)臨床的常用藥物，還常通過拌料做藥物預(yù)防，為兩種藥物的耐藥菌的產(chǎn)生和持續(xù)存在提供了必需的選擇壓力。另一方面，本研究分離的豬沙門對頭孢類、碳青霉烯類、喹諾酮類以及氨曲南、阿米卡星的體外試驗(yàn)?zāi)退幝实?，可為臨床用藥提供參考，但應(yīng)除去其中的一代、二代頭孢菌素、頭霉素類、氨基糖苷類，原因是沙門菌對這幾類藥物天然耐藥，即使一些沙門菌株在體外試驗(yàn)中對其表現(xiàn)敏感，但臨床治療效果差或完全無效。