張培海，李廣森△，常德貴，蔡 劍，曲曉偉，黃曉朋，陳帝昂，尤耀東，俞旭君，張 磊

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,成都 610072；2.河南省人民醫(yī)院,鄭州 450003； 3.成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 610075；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,成都 610041)

近年來，受環(huán)境污染、心理壓力過大、生活方式改變等因素的影響，男性不育的發(fā)病率顯著上升，在過去幾十年間，我國年輕男性精液質(zhì)量有明顯下降趨勢[1]。有研究顯示，男性因素在我國不孕不育育齡人群中占到50%[2]，據(jù)統(tǒng)計主要原因為弱精子癥[3]。因為弱精子癥的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，所以臨床缺乏有效的治療措施，對于中醫(yī)藥治療男性不育的效果研究由來已久，且取得了較好療效[4]。強(qiáng)精片(原名增精1號)經(jīng)課題研究小組多年臨床經(jīng)驗總結(jié)研制而來，以補腎填精、益氣養(yǎng)血、化瘀利濕為治療原則。臨床隨機(jī)對照試驗研究結(jié)果顯示效果滿意[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該藥對大鼠附睪功能性指標(biāo)具有顯著改善和調(diào)節(jié)作用[6-7]，同時能通過降低睪丸內(nèi)FasL凋亡因子表達(dá)，提高大鼠生殖功能[8]。本研究擬通過觀察強(qiáng)精片對弱精子癥SD大鼠精子鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量的影響，就其作用機(jī)理作進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量200～230 g，成都達(dá)碩動物實驗有限公司提供，均自由采食、飲水，飼養(yǎng)于室溫20～30 ℃，12 h光、12 h暗的條件下馴養(yǎng)1周后使用。

1.1.2 實驗藥物 強(qiáng)精片，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供(規(guī)格0.35 g/片，100片/瓶，批號000613)。用時將強(qiáng)精片研末溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液(CMC-Na)，分別配制成相應(yīng)濃度的混懸液備用。奧硝唑用1%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制。

1.1.3 主要試劑和儀器 Rat TUBB ELISA kit(批號Rr1068X)L；TCTE3抗體，兔多克隆抗體(批號ab139825)；MDHC7抗體，山羊抗體(批號SC-102481)；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(批號ab6721)；辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素(HRP/A-V)(批號13152A11)；垂直電泳槽、DYY-6C電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀等(美國Bio-RAD公司)；Thermo全功能酶標(biāo)儀(型號MK3，美國ThermoFisher儀器有限公司)；WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 將100只大鼠按體質(zhì)量分層后隨機(jī)分為空白組、模型組、強(qiáng)精片高劑量組(高劑量組)、強(qiáng)精片中劑量組(中劑量組)、強(qiáng)精片低劑量組(低劑量組)5組各20只。弱精子癥動物模型參照熊芬等[3]方法制作，各實驗組分別給予奧硝唑(ORN)200 mg/(kg·d)灌胃，空白組給予等量1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液灌胃?？瞻捉M1%羧甲基纖維素鈉溶液1 ml/100 g，模型組200 mg/(kg·d) ORN，高劑量組6700 mg/(kg·d)強(qiáng)精片+200 mg/(kg·d)ORN，中劑量組3300 mg/(kg·d)強(qiáng)精片+200 mg/(kg·d)ORN，低劑量組1700 mg/(kg·d)強(qiáng)精片+200 mg/(kg·d)ORN。中藥各組在灌胃ORN混懸液前給予不同濃度的強(qiáng)精片混懸液，每周給藥6 d，每天1次，連續(xù)20 d。大鼠每日稱重1次，根據(jù)變化調(diào)整給藥劑量。

1.2.2 標(biāo)本取材 于末次給藥24 h后，用25%氨基甲酸乙酯(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，剪開右側(cè)股動脈采血，后快速打開腹腔剝離大鼠睪丸與附睪。

1.2.3 指標(biāo)檢測

(1)精液分析：稱右側(cè)附睪質(zhì)量置于水浴箱中預(yù)溫的Hams'F10培養(yǎng)液中剪碎，37 ℃溫育30 min，待附睪精子充分游離后攪拌均勻，取1滴于精子計數(shù)板上檢測精子數(shù)量和精子活力。

(2)Western印跡法檢測MDHC7、TCTE3表達(dá)：取液氮凍存的純化精子放置在冰上溶解，加入滅菌PBS(pH7.4) 洗滌3次，3000×g離心5 min棄上清。加入30 μL RIPA裂解液(臨用前按100∶1比例加入蛋白酶抑制劑PMSF)每10 min渦旋混勻1次，冰上裂解。30 min后將充分裂解的精子4 ℃ 12000 ×g離心10 min，上清即為精子蛋白。BCA法測定蛋白濃度，蛋白等量上樣，10%SDS-PAGE 凝膠電泳，200 mA 100 min轉(zhuǎn)膜，用5%BSA(TBST配制，0.05 g/ml)室溫?fù)u床封閉1 h，加入兔抗MDHC7抗體(1∶200)、TCTE3 抗體(1∶200)和β-actin(1∶5000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入1∶5000稀釋的羊抗兔IgG-HRP孵育1.5 h，TBST洗滌3次，暗室曝光，上機(jī)掃描，以β-actin為內(nèi)參照，用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。

(3)ELISA法檢測血清TUBB表達(dá)：ELISA法測定血清中TUBB含量，測定前盒內(nèi)所有試劑均恢復(fù)至室溫，檢測TUBB，以試劑盒所示的標(biāo)準(zhǔn)品原始濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在酶標(biāo)儀450 nm波長下測得各標(biāo)本吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線相比得到對應(yīng)濃度，再乘以相應(yīng)的稀釋濃度，即為TUBB實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 附睪精子參數(shù)

表1顯示，與空白組比較模型組a、b、c級精子差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，各組精子密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組a、b、c級精子差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

表1 各組大鼠附睪精子參數(shù)比較[例(%)]

注：與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 對MDHC7、TCTE3、TUBB表達(dá)的影響

圖1表2顯示，與空白組比較，模型組MDHC7、TCTE3、TUBB表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組MDHC7、TUBB表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著強(qiáng)精片劑量增加，睪丸中MDHC7、TCTE3、血清TUBB表達(dá)量逐漸增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠MDHC7、TCTE3、TUBB表達(dá)比較

注：與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05

圖1 Western印跡檢測大鼠睪丸組織中MDHC7、TCTE3蛋白表達(dá)比較

3 討論

男性不育是男科的常見病、多發(fā)病，由男性因素所致不育在不孕不育夫婦中約占55.73%[9]。精子活力是衡量精液質(zhì)量和男性生育能力的重要標(biāo)志，弱精子癥是其中的常見類型。男性不育患者中超過19%存在弱精子癥，是導(dǎo)致男性不育的重要因素之一[10]。

中醫(yī)藥在弱精子癥的治療中具有重要作用[11]，多從腎虛、肝郁、氣虛、血虛、痰濕、血瘀等方面論治[12]。根據(jù)課題小組的臨床研究，認(rèn)為腎虛、血瘀、濕熱為主要病機(jī)，確立了補腎填精、益氣養(yǎng)血、化瘀利濕的治療原則，研制出院內(nèi)制劑強(qiáng)精片。前期研究[5]和多方面數(shù)據(jù)證實，其具有改善精子密度、活力、形態(tài)的作用，主要通過增加附睪液SA含量、降低精子膜GPC含量提高睪丸附睪器官系數(shù)，促進(jìn)損傷附睪上皮恢復(fù)和上皮細(xì)胞的分泌來改善附睪精子成熟功能，提高精子質(zhì)量；另可通過調(diào)節(jié)大鼠細(xì)胞凋亡通路Fas/FasL提高生育力[6-8]。

精子細(xì)胞通過復(fù)雜的信息傳導(dǎo)、能量物質(zhì)代謝過程，最終在軸絲復(fù)合體的基礎(chǔ)上，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能。奧硝唑主要作用于垂體性腺軸低端，改變附睪組織功能，影響精子變態(tài)末期和成熟期導(dǎo)致精子活動能力下降，停藥后精子活力可逐漸恢復(fù)正常。本研究中模型組精液密度未見明顯降低，a、b級精子比例降低，與文獻(xiàn)報道一致[13-14]。弱精子癥是由多種原因造成的臨床綜合征，表現(xiàn)為精子運動能力不足，其中精子結(jié)構(gòu)缺陷尤其是精子尾部結(jié)構(gòu)改變尤為突出。精子尾部結(jié)構(gòu)改變通常包括軸絲異常和軸絲周圍結(jié)構(gòu)異常，造成異常最重要的原因就是精子鞭毛結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白異常。深入研究與弱精子癥相關(guān)的特異或非特異蛋白，將為其發(fā)病機(jī)制提供新的線索和標(biāo)志。因此，改善精子鞭毛軸絲蛋白表達(dá)能促進(jìn)鞭毛運動，從而提高精子活力是治療弱精子癥的一個有效途徑。

微管蛋白(TUBB)是紡錘體的主要組成元件，是纖毛和鞭毛等細(xì)胞器官，與細(xì)胞的運動、分裂、物質(zhì)運輸?shù)裙δ苊芮邢嚓P(guān)。正常精子在電鏡下可觀察到尾部具有特點的“9+2”微管結(jié)構(gòu)，微管蛋白降低或斷裂可能會導(dǎo)致物質(zhì)運輸障礙，使精子壽命縮短[15]。奧硝唑會導(dǎo)致小鼠精子尾部微管蛋白排列混亂[11]，本研究中隨強(qiáng)精片用量增加，血清TUBB濃度增加，強(qiáng)精片可能減少奧硝唑?qū)有纬蛇^程中精子尾部支撐骨架形成的影響。

大鼠動力蛋白重鏈7(MDHC7)是人類動力蛋白重鏈7(HDHC7)同源蛋白，也稱軸絲動力蛋白重鏈1(DNAH1)，該基因缺失可導(dǎo)致精子直線和前向運動能力降低。敲除大鼠MDHC7基因后，發(fā)現(xiàn)大鼠精子運動路徑速度均降低，鞭毛拍擊振幅下降，同時電鏡下可見軸絲 C-末端動力蛋白臂缺失[13]。本研究中，隨著強(qiáng)精片劑量增加，睪丸MDHC7表達(dá)量逐漸增加，高劑量組顯著高于模型組，表明使用高劑量強(qiáng)精片改善精子活力可能與MDHC7表達(dá)量增加有關(guān)。

T復(fù)合體相關(guān)睪丸表達(dá)3(TCTE3)又名 tctex2，是 tctex 家族成員之一 (該家族包括 tctex、tctex1&1 L、tctex2&2β、tctex5)，由 198 個氨基酸組成，大小為 23 ku，是精子鞭毛中段軸絲一種外側(cè)臂輕鏈蛋白，表達(dá)于精子尾部鞭毛中段軸絲的外側(cè)雙聯(lián)微管[16]。TCTE3表達(dá)量低是應(yīng)發(fā)原發(fā)性纖毛不動癥的重要原因[17]。Rashid等[18]敲除大鼠TCTE3后發(fā)現(xiàn)，精子出現(xiàn)畸形、運動不協(xié)調(diào)現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性弱精子癥患者精子中TCTE3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降[14]。TCTE3 表達(dá)降低可能會引起精子鞭毛軸絲雙聯(lián)微管內(nèi)側(cè)輕鏈缺失，致使精子活力低下，最終導(dǎo)致不育癥的發(fā)生。

綜上，強(qiáng)精片治療弱精子癥療效肯定，初步機(jī)理研究顯示其能有效改善附睪、精子膜功能，從而改善精子質(zhì)量。因此，以精子鞭毛動力蛋白作為切入點，通過測定弱精子癥大鼠T復(fù)合體相關(guān)睪丸表達(dá)3(T.Complex associated testis expressed 3，TCTE3)、軸絲動力蛋白重鏈7(mouse dynein heavy chain 7，MDHC7)、微管蛋白(tubulin，TUBB)在強(qiáng)精片干預(yù)前后的表達(dá)水平，了解強(qiáng)精片對精子鞭毛動力蛋白合成的作用，進(jìn)一步探究該藥物治療男性不育的作用機(jī)理。本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，隨著強(qiáng)精片劑量增加，a、b、c級精子比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組MDHC7、TUBB表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，血清TUBB表達(dá)量逐漸增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示下一步研究應(yīng)進(jìn)一步提高用藥劑量且驗證效果。

本研究表明，強(qiáng)精片改善弱精子癥模型大鼠精子活力效果隨藥物劑量增加而逐漸增強(qiáng)，并可能通過增加精子尾部鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白TUBB、DMHC7、TCTE3的表達(dá)，從而提高精子活力，其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。