趙曉菊 張麗霞 滿秀玲

(1.大慶師范學院生物工程學院，大慶 163712； 2.東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040)

鹽是限制植物生長發(fā)育的主要因子，鹽脅迫一定程度影響種子萌發(fā)和幼苗生長，破壞植物體內生物膜的結構，影響代謝過程[1]。為抵御鹽脅迫的傷害，植物會產生一系列生理生化改變[2]，如提高次生代謝產物等，有研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會促進長春花(Catharanthusroseus)生物堿合成[3]，這將進一步擴大鹽堿地種植和海水灌溉的實施空間。

長春花為夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬(Catharanthus)植物，因體內含有長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)等130種生物堿類，是國際上研究和應用最多的抗癌植物[4～5]。目前長春花中生物堿類主要是從天然植株中提取，且主要通過外界脅迫促進其生物合成[6]，但脅迫往往會抑制植株生長，造成生物堿提高幅度不大，所以在脅迫的同時添加一種緩解物質，對于長春花生物堿提取具有生產意義。

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種重要的信號分子，在植物體內主要通過一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)催化形成[7～8]，參與植物種子萌發(fā)、生長、發(fā)育等過程，尤其對非生物脅迫的響應方面具有重要的調節(jié)作用[9～11]。國內外對NO作為防御響應中的關鍵信使緩解植物受到鹽脅迫的應用報道很多，如NO可緩解小麥種子萌發(fā)過程中鹽脅迫的傷害作用[12]，低濃度NO處理能延緩水稻在鹽脅迫和高溫脅迫下葉片葉綠素的降解，維持光系統(tǒng)的高活性[13]，外源NO可減緩鹽脅迫對黃瓜根系氧化酶系統(tǒng)的傷害[14]。長春花是重要的抗癌植物之一，體內藥用生物堿與植株耐鹽性密切相關，鑒于此，本實驗以藥用植物長春花為研究材料，研究了外施不同濃度的NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SPN)對鹽脅迫下長春花萌發(fā)與生長的影響，以期為長春花的鹽堿地種植和海水澆灌提供參考，并為進一步研究NO信號緩解長春花耐鹽性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試材及處理

供試長春花種子由東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室提供。選取飽滿一致的粉紅花長春花種子，用3%的NaClO溶液浸泡5 min后，用去離子水洗凈、吸干，將固定數(shù)量的種子放入墊有脫脂棉直徑為9 cm的潔凈培養(yǎng)皿中，按表1設置7組，每組3個重復。在光照培養(yǎng)箱(ZPW-400,China)內進行吸漲萌發(fā)，培養(yǎng)條件：光照時間(日/夜12 h/12 h)，溫度(日/夜25℃/18℃)，濕度為80%。

長春花幼苗的培養(yǎng)選取顆粒飽滿的長春花種子，用10%的NaClO消毒后，均勻播種于育苗盆中，保持適當濕潤的環(huán)境，待小苗長出真葉后選取長勢一致的長春花幼苗，移栽入裝有蛭石下部具孔，透氣性良好的育苗盆(10 cm×10 cm)中，將長春花幼苗置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光照時間(日/夜12 h/12 h)，溫度(日/夜25℃/18℃)，濕度為60%，定期澆灌1/2的Hogland’s營養(yǎng)液(pH=6.0)。

表1 外源硝普鈉處理方案

待幼苗生長出木質部后，隨機挑選相同生長時期幼苗，以正常條件作為對照用CK表示，在50 mmol·L-1NaCl溶液中，加入0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol·L-1SNP進行處理，連續(xù)5天每天上午九點取樣測定NR活性動態(tài)變化；測定0、2、4、6、24 h內脯氨酸(Proline，Pro)含量變化；處理15 d后的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量變化，每次測量3次平行重復。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)實驗方法

長春花種子置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)后每隔24 h觀察記錄每個培養(yǎng)皿中種子萌發(fā)數(shù)，第7 d時將培養(yǎng)皿里的長春花種子用蒸餾水沖洗，將種子表面的水分用吸水紙吸干，測量種子的根長、芽長，分別計算出發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率=7 d內供試種子的發(fā)芽數(shù)÷供試種子數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽勢=3 d內供試種子的發(fā)芽數(shù)÷供試種子數(shù)×100%

(2)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt

(3)

式中：Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=GI×S

(4)

式中：GI為發(fā)芽指數(shù)；S為芽的長度。

1.2.2 生理指標測定

參照張志良等的方法[15]，準確稱量長春花植株葉片鮮重，充分混合后，葉片中MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法測定，以μmol·g-1FW表示MDA含量；Pro采用磺基水楊酸法，以μg·g-1FW表示Pro含量，NR采用活體法測定(標準曲線)，以μg·g-1·h-1表示NR活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析，并運用Duncan’s檢驗法進行多重比較。應用Graph Pad Prism 5.0對試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果進行作圖。

2 結果與分析

2.1 外源NO對鹽脅迫下長春花種子萌發(fā)的影響

圖1 SNP對鹽脅迫下長春花種子發(fā)芽參數(shù)的影響 圖中不同字母表示差異達到5%顯著水平，下同。Fig.1 The effects of SNP on germination parameters of seeds in Catharanthus roseus under NaCl stress Different letters above the bars mean significant difference at 5% level,the same as below.

如圖1所示，50 mmol·L-1NaCl脅迫下，長春花種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均低于對照組，添加0.1 mmol·L-1SNP處理后均高于NaCl脅迫下，可見低濃度SNP可緩解NaCl脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用，隨著SNP濃度的不斷加大，緩解作用降低，甚至一定濃度起到了抑制作用。長春花種子發(fā)芽率是對照組與鹽脅迫中加入0.1和0.5 mmol·L-1SNP無差異顯著性，說明鹽脅迫中加入適當?shù)蜐舛鹊腟NP可恢復發(fā)芽率到正常狀態(tài)，加入2.0 mmol·L-1SNP時發(fā)芽率比單獨鹽脅迫還低，證實高濃度SNP抑制種子的萌發(fā)。發(fā)芽勢是50 mmol·L-1NaCl脅迫和加入不同濃度的SNP均顯著低于對照組，低濃度SNP(0.1 mmol·L-1)可有效提高發(fā)芽勢，而高濃度SNP(1.0和2.0 mmol·L-1)比單獨鹽脅迫發(fā)芽勢還低。整體上長春花種子的發(fā)芽指數(shù)隨SNP濃度的升高而降低，鹽脅迫下低濃度SNP有一定緩解作用。

如圖2所示，在鹽脅迫下長春花芽長、根長明顯低于對照組，加入0.1 mmol·L-1SNP芽長、根長與對照組無顯著差異，大于0.5 mmol·L-1SNP處理下明顯抑制芽和根的長度。

圖2 SNP對鹽脅迫下長春花種子根長、芽長的影響Fig.2 The effects of SNP on shoot and root length in C.roseus seeds under NaCl stress

活力指數(shù)變化趨勢整體上同發(fā)芽指數(shù)一致，與對照相組比，鹽脅迫下長春花種子活力指數(shù)明顯降低，在鹽脅迫下種子活力指數(shù)整體趨勢是隨SNP濃度的升高而降低，當SNP濃度為0.1和0.5 mmol·L-1時，長春花種子活力指數(shù)高于50 mmol·L-1NaCl脅迫組，起到有效緩解作用(表2)。

表2SNP對鹽脅迫下長春花種子的活力指數(shù)影響

Table2TheeffectsofSNPonseedvigorindexinC.roseusunderNaClstress

SNP濃度SNP content(mmol·L-1)發(fā)芽指數(shù)Germination index(%)芽長Root length(cm)活力指數(shù)Vigor indexCK(1/2 Hogland’s)43.38±1.15a0.97±0.012a42.11±1.62aST(50mmoL·L-1 NaCl)35.63±1.73b0.83±0.029b29.67±2.47cST+0.136.13±1.15b0.98±0.0058a35.42±1.34bST+0.227.37±1.15d0.86±0.012b23.56±1.31dST+0.533.88±0.577c0.92±0.029a31.20±1.51cST+1.026.57±0.577d0.73±0.017c19.42±0.882eST+2.023.13±0.577e0.52±0.012d12.04±0.567f

注：不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letters indicate the significant difference among different treatment(P<0.05).

2.2 外源NO對鹽脅迫下長春花幼苗NR活性的影響

由圖3可知，分別在1～5 d同一時間測定的NR活性都呈先上升后下降的趨勢，均在0.5 mmol·L-1SNP下達到最高值，NR活性在107.63～132.62 μg·g-1·h-1，小于0.5 mmol·L-1SNP處理下，隨著濃度的升高，NR活性增強，大于0.5 mmol·L-1SNP后隨著濃度升高NR活性降低。

圖3 SNP對鹽脅迫下長春花葉片內NR活性的影響Fig.3 The effects of SNP on NR in C.roseus seedlings under NaCl stress

測量NR活性隨著外源NO作用時間的延長NR活性先升高(1 d<2 d<3 d<4 d)后下降(4 d>5 d)，各SNP濃度下NR活性均在第4 d時達到最高值，第5 d比第4 d略有下降也相對較高。

在50 mmol·L-1NaCl脅迫下5 d內測定的NR活性無差異顯著性，平均值為71.654 μg·g-1·h-1，而施加SNP后NR活性均高于鹽脅迫下，在0～0.5 mmol·L-1SNP對鹽脅迫傷害NR活性緩解作用尤為顯著，1.0～2.0 mmol·L-1SNP對緩解鹽脅迫作用下降。

2.3 外源NO對鹽脅迫下長春花幼苗Pro含量變化的影響

由圖4可知，0 h(指剛施加SNP后)和24 h對比分析(即間隔一天的同一時間段)，在50 mmol·L-1NaCl脅迫(SNP濃度為0時)下，Pro含量由43.125～49.533 μg·g-1FW，上升了14.85%；50 mmol·L-1NaCl+0.05 mmol·L-1SNP處理下，Pro含量由54.154～51.975 μg·g-1FW，下降了4.02%；50 mmol·L-1NaCl+0.1 mmol·L-1SNP處理下，Pro含量由49.933～52.875 μg·g-1FW，上升了5.89%；50 mmol·L-1NaCl+0.5、1.0、2.0 mmol·L-1SNP處理，差異不顯著。說明0.1 mmol·L-1SNP對50 mmol·L-1NaCl鹽脅迫下的長春花幼苗在24 h內即有顯著緩解作用，而濃度大于0.1的緩解效果不明顯或無效果。在所有測量中2 h下Pro含量最低，可能原因是外界處理后脯氨酸含量均迅速上升，在2 h略有緩和后再次上升，是植物對外界反應的一種應激性。

圖4 SNP對鹽脅迫下長春花內Pro含量的影響Fig.4 The effects of different contents of SNP on soluble pro content in C.roseus seedlings under NaCl stress

2.4 外源NO對鹽脅迫下長春花幼苗MDA含量變化的影響

50 mmol·L-1NaCl單獨處理時(SNP為0)，長春花葉片MDA含量約為0.100 3 μmol·g-1FW，顯著高于未經鹽脅迫處理的(對照組)0.086 35 μmol·g-1FW，增加了16.15%。與50 mmol·L-1NaCl脅迫相比，0.1～1.0 mmol·L-1SNP處理均可降低鹽脅迫下MDA含量，2.0 mmol·L-1SNP與之無顯著差異，其中1.0 mmol·L-1SNP含量較低為0.0791 μmol·g-1FW，與NaCl單獨處理相比降低了20.57%，差異顯著。當SNP濃度高于0.2 mmol·L-1后，MDA的含量整體趨勢隨著SNP濃度的升高而增大(圖5)。

圖5 不同濃度SNP對鹽脅迫下長春花幼苗MDA含量的影響Fig.5 The effects of different contents of SNP on MDA content in C.roseus seedlings under NaCl stress

3 討論

鹽脅迫損害植物細胞的正常代謝過程，尤其是發(fā)芽期和幼苗期最為敏感[16]。植物細胞中的NO具有雙重作用：低濃度的NO能夠促進植物的生長與發(fā)育，提高植物的抗逆性；而高濃度的NO則對植物細胞有毒害作用。在對非生物脅迫的反應中，NO能夠減輕活性氧對植物細胞的傷害，并和其他的信號分子結合，共同調節(jié)脅迫響應基因的表達，SNP作為NO供體，0.5 mmol·L-1SNP處理2 h約能生成2.0 μmol·L-1的NO[17]。本實驗在SNP處理對鹽脅迫下長春花幼苗NR活性和Pro含量的變化研究基礎上，參考NO對鹽脅迫下冰葉日中花種子萌發(fā)設定范圍[18]，研究了0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mmol·L-1SNP處理對鹽脅迫下長春花種子萌發(fā)的影響，研究結果表明50 mmol·L-1NaCl抑制種子發(fā)芽，影響種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)，低濃度的SNP處理對鹽脅迫下長春花種子萌發(fā)具有明顯的保護作用，緩解鹽脅迫對種子細胞膜修復的抑制作用，可明顯提高種子的萌發(fā)率；大于0.5 mmol·L-1SNP會加重鹽脅迫傷害，使鹽脅迫下長春花種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等降低，證實高濃度的SNP抑制植物種子萌發(fā)。

長春花作為一種抗癌藥用植物，促進其體內具有藥效活性的生物堿類合成事關民生，也是栽培長春花的首要意義。已有研究表明，50 mmol·L-1NaCl處理對長春花吲哚生物堿代謝的促進作用最大[4]，所以本實驗選取濃度為50 mmol·L-1NaCl作為鹽脅迫處理，并且針對不同生理指標變化的特性，選取不同時間段進行研究，如自然條件下NR活性在上午九點較強，研究了5 d內每天九點的NR活性動態(tài)變化；植株內Pro含量變化較為迅速，研究了處理后24 h內的動態(tài)變化；MDA作為脂質過氧化的產物之一，研究了處理15 d后MDA含量變化，從不同角度揭示NO對鹽脅迫下長春花幼苗生理代謝的影響。

NR作為氮同化代謝的關鍵酶和限速酶，催化NO3-到NO2-，也是植物體內促進形成NO的催化酶之一，與植物氮同化能力密切相關，對植物的生長起著至關重要的作用[19]。該酶對鹽脅迫很敏感，鹽脅迫使得NR活性下降，葉片內體內NO3-積累，而NO2-下降，含氮化合物的代謝紊亂[20]。本實驗中施加SNP后的NR活性均高于鹽脅迫組，與樊懷福等對黃瓜幼苗的研究相一致[21]，由此可知，外源NO可以有效提高NR活性來緩解鹽脅迫對植物生長造成的不良影響，其中0～0.5 mmol·L-1緩解作用顯著，1.0～2.0 mmol·L-1SNP緩解作用下降，這與低濃度NO促進植株生長提高抗逆性，高濃度抑制生長的相機理一致。對鹽脅迫下長春花幼苗施加SNP后，NR活性在1～4 d呈逐漸上升趨勢，第5 d也相對較高，對于用海水澆灌或者鹽堿土栽培的長春花，可選擇0.1～0.5 mmol·L-1SNP來促進氮代謝，并且在澆灌后的第5 d開始進行采收。

鹽脅迫下，植物合成一些小分子有機物質以增強其滲透調節(jié)能力，改善水分狀況。Pro作為一種重要的滲透調節(jié)物和抗氧化物質，在鹽脅迫下含量會有所積累，避免細胞造成氨中毒。外源NO促進了低溫脅迫下黑麥草Pro的積累來提高抗寒性[22]，本研究結果表明0.1 mmol·L-1SNP促進了NaCl脅迫下長春花葉片Pro含量積累，該SNP濃度與NO緩解鹽脅迫下番茄幼苗顯著增加Pro含量研究相一致[23]。因此，低濃度NO促進Pro積累，是緩解鹽脅迫下長春花幼苗傷害的重要原因之一。

MDA含量多少是脂質過氧化作用強弱的一個重要指標，鹽脅迫下MDA含量增多，與膜透性增加顯著相關。細胞中MDA含量的高低反映了細胞氧化損傷的程度，本實驗研究結果表明SNP處理降低鹽脅迫導致長春花葉片MDA含量的上升，對鹽脅迫下長春花具有保護作用。Mata等報道了NO對干旱迫引起的小麥幼苗的氧化脅迫具有緩解效應[24]，是由于活性氧(ROS)水平的提高誘發(fā)了脂質過氧化鏈式反應，導致細胞膜受到破壞，而NO可直接或間接清除ROS，或降低ROS的產生，中斷氧化脅迫減輕細胞膜損傷有關。

綜上所述，低濃度的NO可有效緩解鹽脅迫對長春花種子萌發(fā)的影響，減輕對幼苗的傷害。NO對鹽脅迫的調節(jié)作用在植物體內是一個非常復雜的生理生化過程，本試驗從幾個生理指標方面探討NO對鹽脅迫下長春花幼苗的影響，還應進一步研究NO對鹽脅迫下長春花生物堿代謝的影響，從生物量積累和代謝響應兩個角度探索提高長春花生物堿產量。