汪俊，王芳，史亞男

(1.武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院，湖北 武漢 430000；2.中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

子宮頸癌作為常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率高、病死率高，且發(fā)病率呈逐年升高，發(fā)病年齡年輕化[1]，監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示[2]，發(fā)展中國家子宮頸癌高發(fā)，每年新發(fā)病例約占全球發(fā)病例的90%，給發(fā)展中國家女性健康帶來嚴(yán)重威脅。T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)作為一種原癌基因，在不同類型細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞遷移、運(yùn)動、黏附、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[3]，有研究指出[4]，Tiam1可通過催化Rho樣鳥苷三磷酸酶(GTPase)并激活Rac1信號通路從而參與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、浸潤等過程。多項研究表明[5-7]，Tiam1在多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究對子宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和正常宮頸組織中Tiam1基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，探討其在子宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料留取2010年1月至2012年1月在武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院行手術(shù)切除的子宮頸組織183例，其中，子宮良性病變留取正常宮頸組織43例，年齡(40.2±10.7)歲，年齡范圍30～65歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織56例(CIN Ⅰ 23例，CIN Ⅱ～Ⅲ 33例)，年齡(39.4±10.1)歲，年齡范圍29～60歲；子宮頸癌組織84例(鱗癌53例，腺癌31例)，年齡(41.3±11.5)歲，年齡范圍31～67歲。三組病例年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均衡可比。所有研究對象采集標(biāo)本前均未接受放化療治療，留取的新鮮組織標(biāo)本分為兩份，一份立刻置于-80 ℃中保存，一份制備石蠟切片。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年分期標(biāo)準(zhǔn)子宮頸癌患者：Ⅰ期28例，Ⅱ期56例；病理分級：G1 15例，G2 38例，G3 31例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；術(shù)后均獲得隨訪，隨訪截止時間2016年12月30日。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑和設(shè)備總RNA提取試劑盒(Trizol法)購自美國Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒均購自日本Takara，Tiam1和內(nèi)參引物均由上海生工公司設(shè)計合成，SP免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB試劑、PBS均購自北京中杉金橋公司，兔抗人Tiam1多克隆抗體購自美國Santa Cruz，實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI，光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus。

1.3方法

1.3.1利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同組織中Tiam1mRNA表達(dá) 取不同子宮頸組織，研磨后，加入細(xì)胞裂解液裂解，用總RNA提取試劑盒提取不同組織中總RNA，利用紫外分光光度計對總RNA純度進(jìn)行檢測，以A260/A280≥1.80作為合格標(biāo)準(zhǔn)。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為，用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：Tiam 1引物：上游：5′-CAGGACTCCACGGGGCCTCA-3′，下游：5′-AGTGCTCCTCGCTCTCCGCA-3′；β-actin引物：上游：5′-CGGG-GTCACCCACACTGTGC-3′，下游：5′-GGGCAGCGGA-ACCGCTCATT-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行36次循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法獲得不同組織中Tiam1基因相對表達(dá)量。

1.3.2利用免疫組織化學(xué)法檢測不同組織中Tiam1蛋白表達(dá) 石蠟標(biāo)本經(jīng)切片、脫蠟、水化后，用3%過氧化氫-甲醇37 ℃孵育30 min對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行阻斷，PBS洗滌3次，加入檸檬酸緩沖液煮沸10 min，冷卻后，PBS沖洗3次，室溫條件下，滴加10%山羊血清封閉20 min，加入一抗兔抗人Tiam1多克隆抗體(1 ∶500)，4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次，以同型IgG作為陰性對照，加入增強(qiáng)劑，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次， DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，于光鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果判定[8]：所有切片均由兩位具有副主任及以上職稱的病理科醫(yī)師獨(dú)立完成，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色、棕黃色或黃褐色染色視為Tiam1蛋白表達(dá)陽性：①染色強(qiáng)度：0分，不染色；1分，染成淡黃色；2分，染成棕黃色；3分，染成棕褐色；②陽性細(xì)胞比例：0分，≤5%；1分，>5%～25%；2分,>25%～75%；3分,>75%；③總評分=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞比例評分。0分，陰性；1～3分,弱陽性；4～6分,中等陽性；7～9分,強(qiáng)陽性；以弱陽性、中等陽性和強(qiáng)陽性作為判斷Tiam1蛋白陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1Tiam1mRNA不同子宮頸病變組織中表達(dá)比較PCR結(jié)果顯示，子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達(dá)量均高于CIN組織和正常宮頸組織，且CIN組織高于正常宮頸組織，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CIN Ⅰ組織中Tiam1 mRNA相對表達(dá)量為(1.54±0.19)，顯著低于CIN Ⅱ～Ⅲ組織的(1.81±0.23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.186，P=0.016)，即子宮頸癌組織> CIN Ⅱ～Ⅲ組織> CIN Ⅰ組織>正常宮頸組織，詳見表1。

2.2Tiam1蛋白在不同子宮頸病變組織中表達(dá)比較子宮頸癌組織中Tiam1蛋白陽性表達(dá)率高于CIN組織和正常宮頸組織(P<0.05)，組間兩兩比較采用χ2檢驗，CIN組織高于正常宮頸組織，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.726，P=0.001)，CIN Ⅰ組織中Tiam1蛋白陽性表達(dá)率為26.1%(6/23)，低于 CIN Ⅱ～Ⅲ組織的60.6%(20/33)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.493，P=0.011)，即子宮頸癌組織> CIN Ⅱ～Ⅲ組織> CIN Ⅰ組織>正常宮頸組織，詳見表2和圖1。

表1 Tiam1 mRNA在不同子宮頸病變組織中表達(dá)比較

注：與正常宮頸組織相比，aP<0.05；與CIN組織相比，bP<0.05

表2 Tiam1蛋白在不同子宮頸病變組織中表達(dá)比較/例(%)

注：與正常宮頸組織相比，aP<0.05；與CIN組織相比，bP<0.05

2.3Tiam1mRNA和蛋白在子宮頸癌組織中表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白陽性表達(dá)率均與臨床分期、病理分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而均與年齡、病理學(xué)類型、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05)，詳見表3。

2.4子宮頸癌組織中Tiam1表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系以子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達(dá)量P25為界值，將患者分為高表達(dá)組(n=63)和低表達(dá)組(n=21)，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)組患者生存時間44.13個月，低表達(dá)組患者生存時間61.00個月，Log-Rank檢驗顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.081，P=0.014)，詳見圖2；子宮頸癌組織中Tiam1蛋白陰性表達(dá)患者生存時間63.76個月，陽性表達(dá)患者生存時間34.67個月，Log-Rank檢驗顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.359，P=0.001)，詳見圖3。以生存時間為因變量，Tiam1表達(dá)(陰性=0，陽性=1)和單因素分析有意義的臨床病理特征為自變量進(jìn)行Cox比例風(fēng)險回歸模型分析，結(jié)果顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Tiam1表達(dá)是患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)，見表4。

表3 Tiam1 mRNA和蛋白在子宮頸癌組織中表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

注：與G1相比，aP<0.05；與G2相比，bP<0.05

表4 影響患者預(yù)后的Cox風(fēng)險回歸模型分析

圖2 子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達(dá)量對生存時間的影響

圖3 子宮頸癌組織中Tiam1蛋白表達(dá)對生存時間的影響

3 討論

子宮頸癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移和侵襲能力，有研究指出[9]，手術(shù)時發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)70%～80%。因此，從分子水平探討影響子宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲的相關(guān)機(jī)制，對該腫瘤早期診斷、提供基因治療靶位及改善患者預(yù)后具有重要意義[10]。Tiam1作為一種重要的促腫瘤轉(zhuǎn)移基因，在調(diào)控二磷酸鳥嘌呤核苷酸和三磷酸鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換，以及催化Ras超家族中發(fā)揮重要作用[11]，與細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化、骨架結(jié)構(gòu)重構(gòu)、運(yùn)動、遷移、侵襲等過程密切相關(guān)[12]。有研究指出[13]，Tiam1蛋白在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤分化、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本研究顯示，子宮頸癌組織中Tiam1基因相對表達(dá)量和蛋白陽性表達(dá)量均高于 CIN組織和正常宮頸組織，且子宮頸癌組織> CIN Ⅱ～Ⅲ組織> CIN Ⅰ組織>正常宮頸組織，說明Tiam1在子宮頸癌組織中呈高表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，Tiam1 mRNA和蛋白在子宮頸癌組織中相對表達(dá)量與臨床分期、病理分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床分期越高、病理分級越高、浸潤深度越深、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Tiam1 mRNA相對表達(dá)量越高，Tiam1蛋白陽性表達(dá)率越高，說明子宮頸癌組織中Tiam1表達(dá)與子宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤、侵襲有關(guān)，張源等[14]亦研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1蛋白表達(dá)水平與胃腺癌分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及漿膜浸潤有關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步提示Tiam1在腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲中發(fā)揮重要作用，參與了腫瘤進(jìn)展過程。有研究指出[15]，Tiam1與惡性腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)測患者預(yù)后的指標(biāo)。Li等[16]指出，Tiam1過表達(dá)是漿液性卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險因素。本研究Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)組患者生存時間44.13個月，顯著低于低表達(dá)組患者生存時間，子宮頸癌組織中Tiam1蛋白陽性表達(dá)患者生存時間34.67個月，顯著低于陰性表達(dá)患者，說明Tiam1表達(dá)與子宮頸癌患者預(yù)后密切相關(guān)，子宮頸癌組織中Tiam1高表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良，可作為預(yù)測患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，Tiam1基因和蛋白在子宮頸癌組織中呈高表達(dá)，可能參與了子宮頸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程，且與患者預(yù)后有關(guān)，有望成為患者預(yù)后預(yù)測的一種潛在分子指標(biāo)。

(本文圖1見插圖9-2)