李立，郭星云，石秀霞

(承德市中心醫(yī)院,河北承德067000)

急性肺損傷(ALI)是重癥醫(yī)學(xué)科最常見的急危重癥之一，后期可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。炎性反應(yīng)失控是ALI的根本原因，其致病因素有多種，其中內(nèi)毒素致膿毒癥時(shí)，ALI的發(fā)生率高達(dá)83%～100%[1]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6是臨床常用的炎癥指標(biāo)。10 號(hào)染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)基因是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，具有磷酸酯酶的活性。PTEN蛋白可通過(guò)拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年來(lái)ALI/ARDS病死率仍居高不下[2]，因此尋找針對(duì)ALI病因的基因治療手段意義重大。miR-214在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3～5],起促炎因子的作用。Cai 等[6]研究發(fā)現(xiàn)包括miR-214在內(nèi)的多個(gè)miRNAs在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的ALI模型小鼠肺組織中表達(dá)明顯升高，然而至今miR-214在ALI發(fā)生中的可能作用及相關(guān)機(jī)制尚未見相關(guān)研究報(bào)道。2017年4月～2017年8月，本研究通過(guò)LPS建立ALI小鼠模型，觀察下調(diào)miR-214表達(dá)對(duì)ALI小鼠ALI的預(yù)防作用，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 健康雄性SPF級(jí)8～10周C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量21～25 g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；miR-214抑制劑antagomiR-214購(gòu)自廣州銳博生物科技公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；miR-214和U6引物設(shè)計(jì)合成由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。

1.2 小鼠分組、ALI模型制備及antagomiR-214給予方法 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，每組10只。模型組、干預(yù)組小鼠參考文獻(xiàn)[7，8]方法制備ALI模型：小鼠支氣管內(nèi)緩慢滴注LPS溶液(5 mg/kg)后縫合傷口。對(duì)照組小鼠支氣管內(nèi)緩慢滴注等量生理鹽水。干預(yù)組小鼠在制備ALI模型前3 d開始給予尾靜脈注射antagomiR-214(80 mg/kg)，1次/天，連續(xù)注射3 d；模型組和對(duì)照組予尾靜脈注射等量生理鹽水。參照美國(guó)胸科協(xié)會(huì)ALI模型的作用條件[9]:造模24 h時(shí)完整取出肺組織。在氣管叉處結(jié)扎右側(cè)主支氣管，應(yīng)用注射器經(jīng)氣管緩慢注入冷PBS 2 mL行左肺支氣管肺泡灌洗，用注射器輕輕緩慢沖洗左肺3 遍，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，重復(fù)3次。BALF 4 ℃、2 000 r/min離心10 min，離心后取上清液置于-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。冰面上取得右肺下葉置于液氮中速凍后置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 BALF蛋白含量、細(xì)胞總數(shù)檢測(cè) 取BALF離心后上清液，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒的操作說(shuō)明檢測(cè)三組BALF蛋白濃度。將BALF離心后的細(xì)胞團(tuán)重新懸浮，應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 肺組織損傷情況觀察 采用蘇木精-伊紅(HE)染色法測(cè)算肺損傷病理評(píng)分。取右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后切5 μm厚石蠟切片，經(jīng)過(guò)脫蠟、浸泡等常規(guī)處理后HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)結(jié)果，參考文獻(xiàn)[10]依據(jù)肺泡間隔增寬、肺泡腔滲出、肺泡腔出血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等四個(gè)方面的嚴(yán)重程度對(duì)ALI進(jìn)行肺損傷病理評(píng)分：正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 肺組織水腫程度測(cè)算 采用肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量(W/D)比值法。取右肺中葉組織，濾紙沾干表面水分，置入干燥潔凈的小玻璃瓶中稱濕重，75 ℃恒溫烘箱中烘烤24 h至恒重，稱肺組織干重，計(jì)算W/D比值，評(píng)估肺組織的水腫程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 肺組織和BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量檢測(cè) 采用ELISA法。取右肺下葉組織100 mg勻漿，離心收集上清液。同時(shí)取出低溫保存的BALF上清液，嚴(yán)格按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)算TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.7 肺組織中miR-214檢測(cè) 采用Real-time PCR法。取右肺下葉組織100 mg勻漿，TRIzol試劑提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，參照All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit試劑盒說(shuō)明書配置Real-time PCR體系后，進(jìn)行qPCR,反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s，60 ℃，20 s，72 ℃，10 s，45個(gè)循環(huán)。配置PCR反應(yīng)體系，按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，以2-△△Ct代表miR-214的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 肺組織PTEN蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取右肺下葉組織100 mg，RIPA裂解，離心取裂解上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。所有操作均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。ECL顯像曝光后采集圖像，Quality one掃描分析圖像，應(yīng)用GADPH作為內(nèi)參。以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

三組BALF蛋白濃度、BALF蛋白濃度細(xì)胞總數(shù)、肺損傷病理評(píng)分、W/D比較見表1。

表1 三組BALF蛋白濃度、BALF細(xì)胞總數(shù)、肺損傷病理評(píng)分、W/D比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

對(duì)照組小鼠肺組織表面呈淡紅色，光鏡下可見肺組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯損傷表現(xiàn)；模型組小鼠肺組織表面呈暗紅色并伴有明顯滲出，光鏡下可見肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡壁水腫、肺泡間隔明顯增寬、肺泡腔滲出并伴有大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變；干預(yù)組小鼠肺組織表面滲出減少，光鏡下病理性改變較LPS模型組減輕。

三組肺組織和BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較見表2。

表2 三組肺組織和BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較

注：與對(duì)照組比較：aP<0.05；與LPS模型組比較：bP<0.05。

對(duì)照組、模型組、干預(yù)組miR-214相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.03、8.47±0.20、0.40±0.17。與對(duì)照組比較，模型組miR-214相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組miR-214相對(duì)表達(dá)量降低 (P<0.05)。

對(duì)照組、模型組、干預(yù)組PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.12±0.09、0.22±0.10、2.98±0.21。與對(duì)照組比較，模型組PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量升高 (P<0.05)。

3 討論

2012年柏林會(huì)議將ARDS分為輕、中、重度，其中輕型ARDS即以往所說(shuō)的ALI。ALI本質(zhì)上是機(jī)體失控激活和自我放大的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致肺組織損傷，因此研究如何從基因水平抑制炎癥反應(yīng)及級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，對(duì)減慢ALI的進(jìn)程，降低病死率，具有重要意義。miRNA是一類長(zhǎng)19～24 nt的小分子非編碼RNA，其可以通過(guò)與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控，參與機(jī)體多種重要的生理及病理過(guò)程，如炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[11]。Guo等[12]近期在研究中發(fā)現(xiàn)miR-125b在ARDS患者血清及LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠血清及肺組織中表達(dá)明顯降低，升高ALI小鼠肺組織中miR-125b的表達(dá)能夠明顯抑制炎癥反應(yīng)，從而改善LPS誘導(dǎo)的ALI。國(guó)內(nèi)學(xué)者[13]也分別報(bào)道了敲減miR-7或者提高miR-155的表達(dá)能夠有效減弱LPS所致小鼠ALI炎癥反應(yīng)。miR-214是miRNA重要的成員之一，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡及腫瘤等方面發(fā)揮著重要的作用[14]。miR-214在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型肺組織中表達(dá)明顯升高，提示miR-214可能作為促炎因子與LPS誘導(dǎo)的ALI存在著密切關(guān)系[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，LPS模型組BALF蛋白含量和細(xì)胞總數(shù)、肺損傷病理評(píng)分、W/D比值、肺組織和BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯增高，提示ALI小鼠模型建模成功，miR-214在LPS誘導(dǎo)的ALI模型小鼠肺組織中表達(dá)增高。miR-214在活化的T細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，通過(guò)抑制PTEN促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，從而維持T細(xì)胞的活化[4]。并且miR-214可以通過(guò)靶向抑制PTEN，減弱PTEN對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制，從而延緩炎性細(xì)胞的凋亡起著促炎作用[3]。miR-214是否通過(guò)對(duì)PTEN的調(diào)控參與LPS所致ALI尚未見研究報(bào)道。本研究中，模型組小鼠肺組織PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量下降，提示miR-214可能通過(guò)下調(diào)PTEN的表達(dá)參與ALI的發(fā)生發(fā)展。

PTEN基因位于染色體10q2313上，全稱為10 號(hào)染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因，PTEN是PI3K/Akt 通路主要的負(fù)性上游調(diào)節(jié)基因[3]，PTEN功能丟失可激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路。PI3K/Akt通路是機(jī)體炎癥反應(yīng)的最重要通路之一，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，可以促使NF-κB/IκB蛋白磷酸化，從而促使炎性因子大量生成[12]。PI3K/Akt通路可調(diào)節(jié)肺臟的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)肺損傷的發(fā)生，阻斷該信號(hào)通路中的相關(guān)分子的表達(dá)能夠阻斷ALI的發(fā)生[14～16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，干預(yù)組BALF蛋白含量和細(xì)胞總數(shù)明顯減少，肺損傷病理評(píng)分和W/D比值明顯降低，并且肺組織和BALF中的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低，提示下調(diào)miR-214的表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠的急性肺組織損傷，抑制炎癥反應(yīng)。并且我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，干預(yù)組PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量增高，進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)miR-214對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的保護(hù)作用可能是通過(guò)上調(diào)PTEN的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，下調(diào)miR-214表達(dá)可預(yù)防小鼠ALI，其機(jī)制可能與其促進(jìn)PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)量有關(guān)。