廖清池，胡艷麗，周勝華

(1.揚州大學附屬蘇北人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇揚州 225001；2.中南大學湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，湖南長沙 410000)

冠脈側支循環(huán)形成過程即為動脈血管新生的過程，可為冠脈閉塞患者提供替代的冠脈灌注途徑，冠脈側支循環(huán)發(fā)展良好的冠心病患者保留有更好的心臟功能，更少受不良心血管事件的影響，病死率亦更低，因此冠脈側支循環(huán)在冠心病慢性閉塞(CTO)患者中具有重要的臨床意義。microRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，通過mRNA轉錄后抑制或誘導其降解調(diào)節(jié)基因表達。資料表明microRNA可作為區(qū)分患者是否患有心血管疾病的生物標志物，這類疾病主要包括心力衰竭，穩(wěn)定性心絞痛及急性心肌梗死，然而至今有關microRNA與冠心病側支循環(huán)的關系研究仍鮮有報道[1]。microRNA-21(miR-21)已被證實為多種腫瘤的生物標志物，近來研究表明其在促進血管新生中亦起重要作用[2]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下誘導產(chǎn)生的一種轉錄因子，參與機體對缺氧的反應，研究表明亦有促進血管新生的作用。研究表明miR-21可調(diào)控HIF-1α的表達[3-4]。本研究主要探討不同側支循環(huán)的CTO冠心病患者中循環(huán)miR-21表達的差異，并進一步明確miR-21是否可作為預測冠脈側支循環(huán)是否良好的生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年8月至2017年8月在本院住院治療的冠心病患者95例，男60例，女35例，年齡40～79歲(55.7±17.2)歲，均行冠脈造影證實前降支、回旋支或右冠狀動脈至少有一支為CTO病變，根據(jù)冠脈側支循環(huán)是否良好分為側枝良好組53例，側枝不良組42例，所有患者均有超過4周的心絞痛癥狀，符合冠心病診斷標準。排除標準包括：既往心肌梗死、心臟外科手術、左心功能不全、糖尿病、急慢性炎癥、冠狀動脈心肌橋、瓣膜性心臟病、周圍血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、腦血管疾病、腫瘤及重要臟器嚴重功能障礙等。排除糖尿病主要因其對冠脈側支循環(huán)及microRNA表達有潛在影響[5-6]，因此排除此類患者有利于明確microRNA表達水平與冠脈側支循環(huán)的關系。選取同期行冠脈造影正常的住院患者30 例作為對照組，男19例，女11例，年齡39～79(56.3±18.1)歲。 各組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同時收集其他一般臨床資料，主要包括高血壓、高脂血癥病史、吸煙史及相關用藥史[如拜阿司匹林、氯吡格雷、他汀類藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ACEI/ARB)、鈣通道阻滯劑(CCB)、硝酸酯類藥物、倍他樂克、低分子肝素等]，上述指標在CTO兩組患者中比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過本單位倫理委員會批準，所有研究對象均書面知情同意。

1.2方法

1.2.1冠狀動脈側支循環(huán)情況評估 根據(jù)冠脈側支循環(huán)Rentrop分級標準[7]評估冠狀動脈側支循環(huán):0 級為未見側支循環(huán)；1 級為分支冠脈充盈，但主要的心外膜冠脈未見顯影;2級為主要心外膜冠脈部分充盈；3級為主要心外膜冠脈完全顯影。0、1級者為冠脈側支循環(huán)功能不良組(42例)，而2、3 級者為冠脈側支循環(huán)功能良好組(53例)。

1.2.2miR-21、HIF-1α 表達水平檢測及白細胞計數(shù) 各組患者在行冠狀動脈造影術前，于主動脈根部抽取血樣本10 mL，注入事先準備好的無菌檸檬酸鹽試管中，然后置入冰中，并以1 500×g離心20 min，血漿儲存于-80 ℃無RNA酶的小瓶中待用。實時熒光定量PCR法測定血漿miR-21相對表達水平，ELISA 法測定血漿HIF-1α水平，計算白細胞、單核細胞及淋巴細胞總數(shù)。

2 結 果

2.1兩組白細胞、淋巴細胞及單核細胞計數(shù)比較 側支循環(huán)良好組單核細胞計數(shù)較側支不良組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組白細胞、淋巴細胞及單核細胞計數(shù)的比較

a：P<0.05，與側支不良組比較

2.2兩組血miR-21、HIF-1α表達水平比較 側支良好組較側支不良組血漿miR-21、HIF-1α表達水平明顯升高；CTO組miR-21、HIF-1α表達水平較正常對照組減少，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，見表2。

表2 各組血miR- 21、HIF-1α水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與側支不良組比較

2.3冠心病患者側支循環(huán)形成的影響因素 相關分析顯示血漿miR-21表達水平與 HIF-1α表達水平及單核細胞計數(shù)呈正相關 (r=0.804，P<0.05；r=0.784，P<0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示miR-21(OR=4.762，95%CI為2.395～6.164，P<0.05) 及 HIF-1α水平(OR=12.906，95%CI為11.774～15.048，P<0.05) 是CTO患者側支循環(huán)形成良好的預測因子。

2.4血漿miR-21預測效能 根據(jù)Logistic回歸分析的概率值繪制ROC曲線，AUC為0.93(95%CI0.79～0.95，P<0.05)，應用血漿 miR-21表達水平預測CTO患者側支循環(huán)形成的靈敏性及特異性分別為87.5%、94.1%。

3 討 論

近年來miR-21調(diào)節(jié)血管新生的作用已成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)在常氧條件下miR-21可抑制內(nèi)皮細胞介導的血管新生[8]，而其他研究人員在腫瘤細胞中研究發(fā)現(xiàn)miR-21通過激活Akt信號促進血管新生[9]，因此miR-21在不同的細胞類型中發(fā)揮血管新生的調(diào)節(jié)作用不同。既往研究證實miR-21可顯著縮小急性心肌梗死患者心肌梗死面積，表明miR-21在缺血缺氧環(huán)境中可促進血管新生。其機制可能與miR-21作用于10號染色體q23有缺失且與張力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)有關，因后者可以抑制Akt的活化，而Akt活化可促進血管新生。因此miR-21可通過PTEN/Akt信號途徑促進缺血缺氧性血管新生。

盡管目前研究表明miR-21與血管新生的關系密切，但鮮有臨床研究報道m(xù)iR-21與冠脈側支循環(huán)功能程度有關。本研究表明miR-21水平在側支循環(huán)良好的CTO患者血漿中表達明顯增加，并進一步證實miR-21可作為血漿循環(huán)標志物用來區(qū)分CTO患者側支循環(huán)是否良好(靈敏性及特異性分別為87.5%、94.1%)。有趣的是與冠脈造影正?；颊呦啾?，CTO患者血漿中miR-21表達明顯減少，提示miR-21可能是CTO冠心病患者的不利因素。

目前microRNA表達水平與冠心病冠脈側支循環(huán)功能關系如何知之甚少，本研究假定冠心病患者中側支循環(huán)功能程度不同，其血漿中miR-21表達水平亦不同，結果證實miR-21表達水平與冠脈側支循環(huán)程度呈正相關，miR-21可用來區(qū)分冠心病患者冠脈側支循環(huán)功能是否良好，其水平升高提示冠脈側支循環(huán)功能良好，這一點在識別并發(fā)急性冠脈綜合征高風險患者顯得尤為重要。資料表明側支循環(huán)豐富的冠心病患者有利于改善其生存率[10]，令人遺憾的是目前尚缺乏循環(huán)標志物來區(qū)分這類高風險患者。由于miR-21在患者血漿中表達穩(wěn)定，有明顯組織特異性，而且隨所處環(huán)境反應快速，本研究證實在預測CTO患者冠脈側支循環(huán)情況時其敏感度及特異度均較高，因此miR-21作為簡單易測的生物標志物可用來預測冠脈側支循環(huán)是否良好，有利于指導高危冠心病患者的治療及改善其預后。

循環(huán)中白細胞尤其是其中的單核細胞在冠脈側支循環(huán)中起重要調(diào)節(jié)作用，研究表明冠脈側支循環(huán)功能良好與血液循環(huán)中低水平的白細胞總數(shù)及高水平的單核細胞有關[11]，本研究結果表明冠脈側支循環(huán)良好組單核細胞明顯升高，與前述研究一致，進一步行相關分析發(fā)現(xiàn)miR-21與循環(huán)中單核細胞存在明確正相關，推測其機制可能與單核細胞分泌miR-21有關[12]。此外有研究發(fā)現(xiàn)淋巴細胞計數(shù)與冠脈側支循環(huán)功能是否良好相關[13]，本研究顯示淋巴細胞計數(shù)及白細胞總數(shù)在冠脈側支循環(huán)良好組及不良組間比較均無明顯差別，這可能與本研究選擇CTO冠心病患者作為研究對象有關。HIF-1α在缺氧條件下有促進血管新生的作用。資料表明HIF-1α可誘導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達而縮小心肌梗死面積。研究顯示HIF-1α表達受miR-21調(diào)控[3]，其機制可能與激活Akt信號途徑有關，而后者可促進VEGF的表達。有資料表明在缺氧環(huán)境下抑制miR-21可導致心肌細胞HIF-1α表達減少[4]。本研究結果顯示HIF-1α是冠脈側支循環(huán)的影響因素，而且miR-21與HIF-1α呈正相關，因此推測在CTO冠心病患者中miR-21通過上調(diào)HIF-1α表達而促進冠脈側支循環(huán)形成。此外，研究表明HIF-1α可通過上調(diào)miR-19a促進單核細胞水平上調(diào)及冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生[14]，本研究亦發(fā)現(xiàn)HIF-1α與單核細胞計數(shù)呈正相關，因此HIF-1α發(fā)揮影響冠脈側支循環(huán)的作用可能部分是通過增加血漿中單核細胞計數(shù)實現(xiàn)的。

目前明確冠脈側支循環(huán)功能情況主要依靠冠脈造影等侵入性檢查方法，而冠脈造影亦僅僅提供一種半定量方法來評估冠脈側支循環(huán)功能情況，而且只能探測100 μg以上的血管。因此利用循環(huán)標志物如本研究中證實的miR-21因其簡單易操作且無創(chuàng)的方式來區(qū)分冠心病患者冠脈側支循環(huán)情況就顯得十分有價值?？紤]到那些冠脈側支循環(huán)功能不良的冠心病患者有更高并發(fā)急性冠脈事件的風險及更高的死亡率，因此采用簡單無創(chuàng)的方法有效識別這類患者非常重要。本研究表明miR-21可作為血漿循環(huán)標志物有效區(qū)分CTO冠心病患者冠脈側支循環(huán)功能是否良好，但其具體作用機制尚不明確，因此將來的研究應納入更多的患者群體以進一步明確miR-21在冠脈側支循環(huán)中的作用并進行基礎研究探討其作用機制。